אנו מציגים עבור זיהוי אופטי בזמן אמת של חלבונים יחיד ללא תווית פרוטוקול כפי שהם המופרשים מתאי חי. זה מבוסס על מיקרוסקופ interferometric פיזור (iSCAT), אשר יכול להיות מיושם למגוון רחב של מערכות ביולוגיות שונות ותצורות.
נדגים מיקרוסקופ interferometric פיזור (iSCAT), שיטה מסוגלת גילוי יחיד ללא תווית חלבונים המופרשים מתאים חיים בודדים בזמן אמת. ב פרוטוקול זה, נסקור את השלבים הבסיסיים למימוש במיקרוסקופ iSCAT משלים אותו עם ערוצי הדמיה נוספים כדי לנטר את הכדאיות של תא שנבחנה. בעקבות זאת, אנו משתמשים השיטה לגילוי בזמן אמת של חלבונים יחיד כפי הם מופרשים מן התא החי נדגים עם קו B-cell immortalized (Laz388). הצעדים הדרושים לגבי ההכנה של מיקרוסקופ, לדוגמה, כמו גם הניתוח של נתוני ההקלטות הם דנו. פרוטוקול וידאו מדגים שמיקרוסקופ iSCAT הזה מציע שיטה פשוטה ללמוד הפרשת ברמת מולקולה בודדת.
חלבוני המופרש לשחק תפקיד משמעותי תהליכים פיזיולוגיים שונים1. מסיבה זו, הם הם למדו באופן שגרתי של אנסמבל קולקטיבית (פרוטאומיקס) או ישויות נפרדות2,3. פרוטאומיקס באופן מסורתי חוקר את כל סידרת חלבונים המצויים מערכת ביולוגית מסוימת דרך למשל, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה), cytometry זרימה או ספקטרומטר מסה4,5, 6. חלבונים יחיד, מצד שני, בדרך כלל מזוהים באמצעות מגוון של שיטות המבוססות על קרינה פלואורסצנטית7,8,9,פלזמוניקה10או אלקטרון קריוגני11 microscopies. כל הטכניקות הללו להשתמש מכשירים מורכבים, תיוג או שניהם, לעתים קרובות חוסר דינמיקה מידע כפי שהם רק לספק מידע לטווח ארוך על מערכת שנבחנה.
כאן אנו משתמשים iSCAT12,13 מיקרוסקופ הגיוני הפרשה חלבונים בודדים עם פחות משנייה רזולוציה טמפורלית14. חשוב, הטכניקה מזהה האות פזורים חלש מהותי בכל12,של חלבון14. כמות האור bioparticle קטן מחליקי להרחבה מדרגית עם פולריזביליות שלה. בהנחה כי הצורה של חלבון ניתן לקרב את ערכיהן על ידי מטוס פיזור יעיל הספרה14,15,16, וזה שונה חלבונים יש מדדי השבירה דומה מאוד, האות נמדד ניתן ישירות מחובר משקל מולקולרי (MW) של החלבון. כיול אמפירי של ניגודיות iSCAT לעומת מולקולרית משקל על ידי הפניה מדידות מאפשרת להבחין חלבונים בגדלים שונים. iSCAT ניסויים יכולים בכשלי בקלות על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ17,18, ריאגנטים immunosorbent, כמו גם תוויות פלורסנט או פיזור כדי לאפשר זיהוי מסוים של כל חלבון של עניין14 , 17 , 19.
בעקרון, פונקציות iSCAT על ידי הגברה אור של חלבון מפוזר חלשים באמצעות ערבוב interferometric עם גל הפניה משנית. עוצמת שזוהו () ב- iSCAT מיקרוסקופ מתואר על ידי
איפה הוא עוצמת האירוע,
הוא מקדם עבור התרומה של גל הפניה,
מסמל את הכוח פיזור של הננו-אובייקט שנבחנה, ו
המופע. ההתחלתי בין מפוזרים, הפניה גלי14. גם ששודרו או משתקף הגב התקרית אור משמשת בדרך כלל כגל הפניה, שם בכל מקרה ומקרה
חשבונות עבור transmissivity או השתקפות של תא הדגימה, בהתאמה. המונח
הוא יחסי של החלבון פיזור סעיף קרוס, יכול להיות מוזנחים לעומת המונח קרוס. לפיכך, הגדרת
עבור מלאה התאבכות הורסת, האור שזוהו ניתנת על ידי
איפה
זה את העוצמה הפניה,
הוא עוצמת ההפרעה.
מיקרוסקופ iSCAT מציע שיטה מצוינת ללמוד תהליכים ביולוגיים ברמת מולקולה בודדת. כדוגמה, אנחנו חוקרים תאים Laz388 – וירוס אפשטיין בר (EBV) הפך לימפוציטים B תא קו20,21 – כפי הם מפרישים חלבונים כגון נוגדנים IgG16. עם זאת, השיטה הינו מידע כללי, ניתן להחיל על מגוון רחב של מערכות ביולוגיות אחרות. iSCAT הוא מטבעו לא ספציפי יכול לזהות כל חלבון או ננו-חלקיק או שזה ניתן להרחיב עם שיטות נפוצות functionalization פני השטח לצורך זיהוי ספציפי או מרובבת. את הפשטות ואת היכולת להיות בשילוב עם טכניקות אופטיים אחרים, כגון מיקרוסקופ פלורסצנטיות, להפוך iSCAT משלימים כלי רב ערך ב ביולוגיה של התא.
אחד ההיבטים הכי קריטי להשגת נתונים שימושי iSCAT היא היכולת למצוא את המיקום מוקד נכונה על פני coverslip, וכדי, יתר על כן, תחזיקו בעמדה הזאת במשך פרקי זמן ארוכים. עושים כך תגרום PSFs והורחבו, אותות iSCAT חלש, וחפצים הקשורים להיסחף ב dynamics ניתוחים. מתברר כי מציאת המטוס מוקד על coverslip נקי, חשופות השטח אינה משימה קלה כפי תכונות פני השטח אינם גלויים רקע קרן הפניה גדול (ראה איור 4 d).
Raw iSCAT תמונות מטושטשות לעיתים קרובות על ידי אותות רקע מפני זיהומים חזית גל במקור עירור, ולא יכול לעכב את היכולת למצוא את המטוס הדמיה הנכון. חיסור פעיל חזית גל היא דרך שימושית כדי לעקוף בעיה זו ולנטר לאחר מכן המוקד iSCAT במהלך מידה16. דרך אחת לעשות זאת היא דרך אפנון מדגם מרחבית. בקצרה, מחולל אותות חל על גל מרובע 50 הרץ יציאת בקרה חיצונית של השלב piezo, וכתוצאה מכך אפנון מדגם המרחבי בתדר יישומית (290 ננומטר משרעת). המצלמה סינכרונית רכישות מופעלות מאותו מקור, ובשילוב, באמצעות עקרונות הנעילה, התוצאה14,תמונת חזית גל-פיצוי16. התמונה המתקבלת מראה בדרך כלל על חספוס בפני השטח של coverslip (איור 4e). תכונות קטנות שנותרו על הזכוכית לאחר ניקוי ניתן להביא המיקרוסקופ להתמקד. פרמטרים בשימוש בשלב זה חיסור רקע פעיל עשוי להשתנות בהתאם במסגרת שיעור, זמן החשיפה, או חומרה.
כפי שהוזכר לעיל, מומלץ השימוש במפצל באיכות גבוהה קרן בכיוונון iSCAT (שלב 1.2.1.), כמו הדמיה חפצים כמו לברורות או הפרעות הנובעות מפצלי הקרן מישורי דק להשפיע על התמונה ולנער את המדידה. איור 7 מראה השוואה בין במפצל קרן באיכות נמוכה ובאיכות גבוהה. גם תמונות raw iSCAT מציגים באותו האזור coverslip המכילה כמה חלקיקים שיורית. אותו סידור iSCAT שימש כדי ללכוד גם תמונות, רק קרן המפצל היה להחליף. איור 7 א מראה את התמונה הנוצרת על המצלמה על-ידי השימוש עבה (5 מ מ), קרן מצופים AR, ואני תקוע הפיצול. בשל העיצוב wedged, הקרן משתקף מן המשטח האחורי של המפצל קרן במקביל נגד השתקפות הנובעים המשטח הקדמי, לא נכנס המטרה. אין חפצים הפרעות להתרחש. איור 7 ב מציגה את שדה הראייה אותו על הדגימה אך הפעם נעשה שימוש במפצל דק יותר של מישורי קרן (1 מ מ). שתי השתקפויות של משטחים קדמית ואחורית של המפצל קרן מקבילים, מהורה אל המצלמה. הפרעה חפצים הם נראים בבירור.
איור 7: השוואה של תמונות iSCAT מיוצר עם מפצלי הקרן, נמוך-באיכות גבוהה- תמונת raw iSCAT (א) Resulting על-ידי שימוש במפצל קרן עבה מצופה AR, תקוע 5 מ מ. (b) Resulting iSCAT גלם תמונה של אותו אזור על-ידי שימוש במפצל קרן מישורי בעובי 1 מ מ. מפצלי הקרן שני יש את אותו יחס פיצול (השתקפות 50%, 50% שידור). חפצי הפרעות הנובעות השתקפויות פרנל הם נצפו בבירור בתמונה מיוצר עם המפצל קרן מישורי בעובי 1 מ מ. גודל ברים: 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
ב פרוטוקול זה נתאר ערכת תאורה שדה רחב עבור iSCAT כמו זה הוא מהיר, קל להבין מאפשר חישה מקבילים על פני שטח גדול14. גישה נפוצה אחרת היא להשתמש deflectors אקוסטו אופטי (AODs), לסרוק קרן קונאפוקלית מעבר מדגם ה-12,17. גישה זו מונע את הצורך wavefronts באיכות גבוהה אך מורכבת יותר ניסיוניים הדמיה רחב-שדות קונבנציונלי. יתר על כן, המהירות של תאורה קונאפוקלית מוגבל על ידי AODs. בהתאם לפרמטרים ניסיוני הרצוי, או ערכות תאורה קונאפוקלית או שדה רחב, בעקרון, ניתן להשתמש כדי לזהות יחיד חלבונים המופרשים מתאים חיים.
כפי שפורט ברחבי בפרוטוקול, זה הכרחי כדי למזער את תנודות מכניות לרוחב בשלב הדגימה במיקרוסקופ. אפילו ננומטר סטיות בעמדה של המדגם ניתן להוביל וריאציות במסגרות המצלמה רצופים, לגרום רעש חיצוני משמעותי בתמונה דיפרנציאלית. לכן מומלץ להשתמש במה מיקרוסקופ מכנית יציב וטבלה אופטי לח (שלב 1.1.1.), כדי לכסות את ההתקנה עם וילונות אופטי או לוחות במהלך ניסוי (שלב 3.5.).
ערכת מייצב המוקד הפעיל יכול להיחשב גם למדידות לטווח ארוך. בגישה זו, לייזר השני שולב המיקרוסקופ בסידור גמורה (טיר), לאחר מכן עם תמונה על גבי פוטודיודה רביע. שינויים בפוקוס של המערכת לתרגם displacements לרוחב טיר לייזר ממוקדת דיודה רבעים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בלולאה משוב פעיל כדי לשלוט ציר z של הבמה piezo26. השפעות ארוכות טווח אנכי להיסחף וכך יחוסלו.
מספר שינויים והרחבות ניתן ליישם את הטכניקה הציג לצרכים הספציפיים כתובת ניסיוני. לדוגמה, מיקרוסקופ מסחרי הבמה חממות זמינים זה יכול בקלות להיות שולבו המיקרוסקופ iSCAT עבור הדמיה ארוכת טווח של תאים. ניתן ליישם טכניקות אחרות גם כהשלמה iSCAT הדמיה, כגון וידאו או טיר זריחה microscopies17. להסתגל במערכת שנבחנה, הפרשת iSCAT מדידות יכול להתבצע בתקשורת תא אחרים כגון DMEM או DPBS, עם זאת, ה-pH אינדיקטור פנול אדום יש להימנע ככל זה יכול להפריע הניסוי בגלל ספיגת אור הלייזר. בנוסף, תוספי מזון כמו סרום עגל עוברית (FCS) או אנושי טסיות lysate (hPL) מכילים חלבונים אשר עלולים להפריע לזיהוי iSCAT. בהתאם רגישות הרצוי של הניסוי, תוספות אלה לא להיות כלולים המדיום מיקרוסקופ.
iSCAT מתבסס על היכולת של analyte פיזור אור – מאפיין זה הוא מהותי כל החלבונים – ולכן הוא מטבעו לא ספציפית. יחד עם זאת, במידה מסוימת היחודיות אפשרי כמו iSCAT סולם אותות באופן ליניארי עם חלבון המונים14,27,28. דבר זה מאפשר הכיול של מערכת iSCAT באמצעות דגימות חלבון סטנדרטית, כגון אלבומין שור (BSA), פיברינוגן14,27,28. למעשה, ממש לאחרונה, ואח צעיר. 28 . יש מורחב על עבודתו של Piliarik & Sandoghdar14 , הראו כי iSCAT יכול לשמש כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של חלבונים קטן כמו streptavidin (53 kDa) עם רזולוציה המונית של 19 kDa, ברמת דיוק של-5 kDa. מספר גישות קונבנציונליות יוכלו להשלים עוד יותר iSCAT על-ידי מתן רמה נוספת של ירידה לפרטים. כמו למשל, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה), ו/או שינוי משטח אחר, להגביל את חלבון מחייב אירועים כך רק את חלבון המטרה היא זיהתה16.
ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר איך מיקרוסקופ iSCAT יכול לשמש כדי לחקור את הפרשות סלולריים באותה רמת חלבון יחיד עם רזולוציה טמפורלית subsecond16. הטכניקה כללי, יכול להיות מיושם על כל מיקרוסקופ מסחריים או מתוצרת בית. בניגוד גישות מולקולה בודדת פלורסצנטיות, השיטה לא סובל photobleaching או למצמץ אפקטים אבל זה עדיין משיגה חלבון יחיד רגישות. תכונות אלה להפוך iSCAT כלי רב עוצמה בתחום של biosensing ומיקרוסקופ. יישומים עתידיים יתמקד שחקרתי אינטראקציות סלולרי מורכבים כגון תגובה חיסונית גירוי או תקשורת סלולרית.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי חברת מקס פלנק פרופסורה של אלכסנדר-פון-הומבולדט, את פתוח (CRC 1181). אנו מודים סטפני שפר-Universitätsklinikum ארלנגן למתן Laz388 תאים, לדיונים שימושי. אנו מודים סימון Ihloff, מקסים שוואב-הזט ב לקבלת תמיכה טכנית.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |