彼らは生きた細胞から分泌される、単一ラベルのない蛋白質のリアルタイム光検出のためのプロトコルを提案します。これは干渉散乱 (iSCAT) 顕微鏡は、様々 な異なる生物学的システムや構成に適用することができますに基づいています。
干渉散乱 (iSCAT) 顕微鏡、リアルタイムで個々 の生きている細胞から分泌される単一のラベルのない蛋白質を検出することができる方法を紹介します。このプロトコルでは、iSCAT 顕微鏡を実現し、調査の下で細胞の生存率を監視する追加画像チャンネルとそれを補完する基本的な手順を取り上げます。次に、彼らは我々 を不死化 B 細胞ライン (Laz388) を示す細胞から分泌されるように単一蛋白質のリアルタイム検出メソッドを使用します。顕微鏡やサンプルの準備だけでなく、記録されたデータの分析に関する必要な手順を説明します。ビデオ プロトコルを示しますその iSCAT 顕微鏡単一分子レベルでの分泌を調査する簡単な方法を提供しています。
分泌されるタンパク質は、様々 な生理的過程1で重要な役割を果たします。このため、彼らは日常的に集団アンサンブル (プロテオミクス)、または個々 のエンティティ2,3として研究されています。プロテオミクスは伝統的など酵素抗体法 (ELISA), フローサイトメトリー、または質量4,5を経由して特定の生物学的システムで現在の蛋白質の全体のセットを調査します。 6。単一蛋白質、他の一方で、さまざまな蛍光7、8プラズモニクス9,10、または極低温電子11に基づく手法を使用して場合は検出されます一般的に々糸。これらすべての技法は複雑な商品、ラベル、またはその両方を使用して、動的情報に欠ける調査の下でシステムの長期的な情報のみを配信。
ここでサブ秒時間分解能14意味個々 分泌蛋白質 iSCAT12,13顕微鏡を使用します。重要なは、技術は蛋白質12,14日ごとに組み込み弱い散乱信号を検出します。その分極率と小さな bioparticle 散乱光の量をスケーリングします。蛋白質の形によって近似できます、効果的な散乱球14,15,16, と異なると仮定すると蛋白質がある屈折率とよく似て、計測された信号を直接することができます。タンパク質の分子量 (MW) に接続されています。参照による分子量対iSCAT コントラストの経験的な校正サイズの異なる蛋白質を区別することができます。iSCAT 実験は興味14のあらゆる蛋白質の特定の検出を実現する蛍光または散乱のラベルと同様、蛍光顕微鏡17,18、抗体試薬によって容易に補完ことができます。,17,19。
原則として、iSCAT はセカンダリ参照波と干渉の混合による蛋白質の弱い散乱光を増幅することによって機能します。検出された強度 ()、iSCAT 顕微鏡によって記述されます
どこ入射強度
参照波の貢献のための係数は、
研究の下でのナノ物質の散乱強度を示すと
、散乱の位相差は、参照波14。いずれか、透過または反射入射光参照波として各場合で用い
それぞれの透過率や反射率サンプル室のアカウントします。言葉
蛋白質の散乱断面に比例しクロスの用語と比較して無視することができます。したがって、設定
完全な破壊的な干渉の検出された光によって与えられる
、
参照強度と
干渉強度です。
iSCAT 顕微鏡では、分子レベルで生物学的過程を研究するための優れた方法を提供しています。Laz388 細胞を調べた例として-エプスタイン ・ バール ウイルス (EBV) 変換 B のリンパ球のセル行20,21 -と彼らは IgG 抗体16等のタンパク質を分泌します。ただし、メソッドは汎用的で、様々 な他の生物系に適用することができます。iSCAT は本質的に特定し、任意のタンパク質を検出することができます。 または特定のまたは多重検出一般的な表面機能化法でナノ粒子またはそれを拡張できます。そのシンプルさと蛍光顕微鏡などの他の光学技術と組み合わせることは、貴重な補完ツール iSCAT を作る、細胞生物学。
役に立つ iSCAT データを入手する最も重要な側面の 1 つは coverslip 表面と、さらに正しい焦点位置を見つけることができる時間の長い期間のためのこの位置を保持します。これを行うに失敗した拡大 Psf、弱い iSCAT 信号および動力学解析にドリフト関連成果物になります。きれいな、裸 coverslip の焦点面を見つけること表面がない簡単な作業表面の特徴は大規模な参照ビーム背景表示されないが分かった (図 4 dを参照)。
生 iSCAT 画像は、励起ソースの波面不純物から生じる、正しい画像平面を見つけるための能力を妨げることができるバック グラウンド信号によってしばしば隠されています。アクティブな波面減算は、この問題を回避し、その後測定16中 iSCAT フォーカスを監視する便利な方法です。これを実現する方法の 1 つは、spatial サンプル変調を通じてです。簡単に言えば、関数発生器は、50 Hz の方形波を適用周波数 (290 nm 振幅) で空間サンプルの変調の結果、ピエゾ ステージの外部制御ポートに適用されます。同期カメラ買収は、同じソースからと、ロックの原理、波面補償画像14,16の結果を組み合わせる場合にトリガーされます。結果のイメージは、通常カバーガラス (図 4e) の表面粗さを示しています。洗浄後のガラスに残って小さな機能を使用して、焦点に顕微鏡を持って来ることができます。このアクティブな背景減算ステップに使用されるパラメーターは、フレーム レート、露出時間、またはハードウェアにより変更もあり。
前述のように、iSCAT セットアップ (ステップ 1.2.1。) の高品質ビーム ・ スプリッターの使用を推奨すると、ゴーストのような工芸品を画像としてまたは薄い平面ビームスプリッターから生じる干渉が画像に影響を与えるし、測定を妨げます。高品質と低品質のビームスプリッターの比較を図 7に示します。両方生 iSCAT 画像は、いくつかの残留粒子を含む coverslip の同じ領域を示しています。両方の画像をキャプチャする使用された同じ iSCAT セットアップ、ビームスプリッターのみが交換されました。図 7aはカメラの厚い (5 mm) の使用によって形成されたイメージを示しています AR コーティングとくさびのビームスプリッター。くさびの設計のためにビームスプリッターの裏面からの反射光は反射面に起因する反平行と客観的に入ることはありません。工芸品の干渉は発生しません。図 7 bのサンプルにビューの同じフィールドを示していますが、この時間薄く (1 mm) 平面ビームスプリッターを使用しました。ビームスプリッターの前面と背面の面から 2 つの反射は平行し、カメラに伝達します。干渉の工芸品が明確に表示されます。
図 7: iSCAT 画像の比較生産高と低品質のビームスプリッター 。(a) 5 mm 厚、AR コーティングおよびくさびのビーム ・ スプリッターを使用しての結果生 iSCAT イメージ。(b)結果生 iSCAT 画像 1 mm 厚い平面のビームスプリッターを使用して同じ領域の。両方のビームスプリッター同じ分割比率 (50% 反射、50% 透過) があります。フレネル反射に起因する干渉の工芸品が 1 mm 厚い平面ビームスプリッターで生成したイメージにはっきりしています。スケール バー: 2 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
このプロトコルでは、実現するために簡単に高速広域14上並列センシングが可能と、iSCAT の広視野照明スキームをについて説明します。音響光学偏向器 (AODs) を使用してサンプル12,17間で共焦点のビームをスキャンする一般的な方法です。この方法は高品質波面の必要があるが、従来の広視野イメージングよりもっと実験的複雑。さらに、共焦点光の速度は、AODs のによって制限されます。目的の実験的パラメーターに応じてどちら共焦点または広視野照明方式、原則として、利用できる生きている細胞から分泌される単一のタンパク質を検出します。
プロトコルで説明したように、顕微鏡の試料ステージで横方向の機械的変動を最小限に抑えることが不可欠です。サンプルの位置でもナノメートル偏差は、連続カメラ フレームの変化につながるし、差分画像で重要な余分なノイズを誘発することができます。したがって、機械的に安定したステージと減衰光学テーブル (手順 1.1.1。) を使用して (手順 3.5。) 実験中に光のカーテンやパネルを使用してセットアップをカバーするために勧めはします。
長期的な測定のため、アクティブなフォーカス安定化スキームが考え。このアプローチで 2 番目のレーザーは内部全反射 (TIR) 配置で顕微鏡に組み込まれて、その後象限フォト ダイオード上にイメージを作成します。システムのフォーカスの変更は、ピエゾ ステージ26の z 軸を制御するアクティブなフィードバック ループに使用することができるは、象限ダイオード上のスポットの TIR レーザーの水平変位に変換します。長期的な垂直ドリフト効果は従って除去します。
いくつかの変更と拡張機能は、アドレス特定実験ニーズに紹介したテクニックに適用できます。たとえば、商業顕微鏡ステージ インキュベーターがありますそれは iSCAT 顕微鏡細胞の長期的なイメージングのために容易に組み込むことが。ISCAT イメージングなどを補完するために他の技術を実装することも共焦点または TIR 蛍光顕微鏡17。ISCAT 分泌測定はを DMEM など DPBS、他の携帯メディアで実施することができる調査の下でシステムに適応するには、ただし、pH インジケーター フェノールレッド避けるべきであるそれはレーザ光の吸収による実験を邪魔することができます。さらに、牛胎児血清 (FCS) やひと血小板ライセート (hPL) のようなサプリメントは、iSCAT 検出と干渉するかもしれない蛋白質を含んでいます。実験の目的の感度に応じて、これらのサプリメントは、顕微鏡媒体から除外すべき。
iSCAT は散乱光に検体の能力に依存している-すべての蛋白質に本質的なプロパティ-はこうして本質的に非特異的なと。それにもかかわらず、特異性のある程度はタンパク質質量14,27,28直線 iSCAT 信号スケールとして可能です。ウシ血清アルブミン (BSA)、フィブリノーゲン14,27,28などの標準的なタンパク質試料を用いた iSCAT システムの校正が可能になります。実際には、非常に最近、若いら28 Piliarik & に対する14の仕事が拡張されていてその iSCAT はストレプトアビジン (53 kDa) のような小さなタンパク質の分子量 19 kDa の質量分解能と約 5 kDa の精度を決定する使用ことができますを示しています。いくつかの従来のアプローチは、特異性の余分なレベルを提供することによって iSCAT をさらに補完できます。例、酵素抗体法 (ELISA)、他の表面改質と標的タンパク質のみが検出された16タンパク質バインディング イベントを制限します。
このプロトコルで iSCAT 顕微鏡を使用してサブ時間分解能16タンパク質 1 分子レベルで細胞の分泌物を調査する方法について述べる。技術は一般的であり、任意の商用または自作顕微鏡に実装できます。単一分子蛍光のアプローチと対照をなして退色からメソッドを受けないまたは点滅効果が、それまだ単一蛋白質の感度を実現します。これらの機能は、iSCAT バイオセンシングと顕微鏡の分野で強力なツールを作る。将来のアプリケーションは免疫反応の刺激や細胞間コミュニケーションなど複雑な細胞間相互作用の解明に焦点を当てます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ドイツ研究振興協会 (CRC 1181)、アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト教授、マックス ・ プランク協会によって支えられました。Laz388 細胞を提供して役に立つ議論のため Universitätsklinikum エアランゲン ステファニー · シェーファーに感謝しますテクニカル サポート、MPL でシモーネ ・ Ihloff とマクシム ・ シュワブに感謝します。
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |