Apresentamos um protocolo para a detecção óptica em tempo real de proteínas sem rótulo única, como eles são secretados de células vivas. Isto é baseado em microscopia de dispersão interferométricas (iSCAT), que pode ser aplicada a uma variedade de diferentes sistemas biológicos e configurações.
Demonstramos a microscopia de dispersão interferométricas (iSCAT), um método capaz de detectar proteínas sem rótulo única, secretadas das células de vida individual em tempo real. Neste protocolo, cobrimos as etapas fundamentais para realizar um microscópio iSCAT e complementá-lo com canais de imagem adicionais para monitorar a viabilidade de uma célula em estudo. Em seguida, usamos o método de detecção em tempo real de proteínas simples como eles são secretados a partir de uma célula viva que demonstramos com uma linha de células B imortalizada (Laz388). Medidas necessárias relativas à preparação do microscópio e da amostra, bem como a análise dos dados registados são discutidas. O protocolo de vídeo demonstra que microscopia iSCAT oferece um método simples para estudar a secreção ao nível único-molécula.
Secretada as proteínas desempenham um papel significativo em vários processos fisiológicos1. Por causa disso, eles são rotineiramente estudados como um conjunto coletivo (proteómica) ou como entidades individuais,2,3. Proteomics tradicionalmente investiga todo o conjunto de proteínas presentes em um determinado sistema biológico por meio de citometria de fluxo, por exemplo, os ensaios imunoenzimático (ELISA) ou espectrometria de massa4,5, 6. Proteínas simples, por outro lado, geralmente são detectadas usando uma variedade de técnicas que se baseiam em fluorescência7,8, plasmonics9,10ou elétron criogênico11 microscopies. Todas essas técnicas usam instrumentos complexos, rotulagem ou ambos e muitas vezes faltam informação dinâmica como eles só entregam informações a longo prazo sobre o sistema sob estudo.
Aqui usamos o iSCAT12,13 microscopia de proteínas secretoras individuais de sentido com resolução temporal de subsegundos14. Importante, a técnica detecta o sinal fraco dispersado intrínseco para cada proteína12,14. A quantidade de luz que dispersa a uma bioparticle pequena escalas com sua polarização. Supondo-se que a forma de uma proteína pode ser aproximada por uma dispersão efetiva esfera14,15,16e que diferentes proteínas têm índices de refracção muito semelhantes, o sinal medido pode ser diretamente ligado ao peso molecular (MW) da proteína. A calibração empírica de contraste iSCAT contra peso molecular por medições de referência permite distinguir as proteínas de diferentes tamanhos. iSCAT experimentos prontamente podem ser complementados por microscopia de fluorescência17,18, imunoabsorção reagentes, bem como etiquetas fluorescentes ou espalhamento para permitir uma detecção específica de qualquer proteína de interesse14 , 17 , 19.
Em princípio, iSCAT funciona amplificando a luz espalhada fraco de uma proteína via interferométricas mistura com uma onda de referência secundário. A intensidade detectada () em um iSCAT microscópio é descrito por
onde a intensidade incidente,
é um coeficiente para a contribuição da onda de referência,
significa a força de dispersão do nano-objeto sob estudo, e
é a mudança de fase entre os dispersos e de referência ondas de14. Ou o transmitida ou refletida de volta luz incidente é normalmente usado como uma onda de referência, onde em cada caso
esclarece a transmissividade ou refletividade da câmara de amostra, respectivamente. O termo
é proporcional a proteína espalhamento de seção transversal e pode ser negligenciada em comparação com o termo Cruz. Definindo assim,
para completa interferência destrutiva, a luz detectada é dado por
onde
é a intensidade de referência e
a intensidade de interferência.
microscopia iSCAT oferece um excelente método para estudar processos biológicos a nível único-molécula. Como exemplo, investigamos as células Laz388 — um vírus Epstein – Barr (EBV) transformado linfócitos B célula linha20,21 — como eles secretam proteínas tais como IgG anticorpos16. No entanto, o método é geral e pode ser aplicado a uma variedade de outros sistemas biológicos. iSCAT é inerentemente inespecífica e pode detectar qualquer proteína ou nanopartículas ou ele pode ser estendido com comuns métodos de superfície functionalization para detecção específica ou multiplexado. Sua simplicidade e capacidade de ser combinada com outras técnicas ópticas, tais como a microscopia de fluorescência, fazem iSCAT uma ferramenta complementar valiosa na biologia celular.
Um dos aspectos mais cruciais para a obtenção de dados de iSCAT útil é a capacidade de encontrar a posição correcta de focal na superfície da lamela e, além disso, para manter esta posição por longos períodos de tempo. Falha ao fazer isso resultará em PSFs ampliou, iSCAT fracos sinais e artefatos associados deriva em análises de dinâmica. Acontece que encontrar o plano focal em uma lamela limpa, nu superfície não é uma tarefa fácil como características de superfície não são visíveis no contexto do feixe grande referência (ver Figura 4-d).
ISCAT-prima imagens são frequentemente obscurecidas por sinais de fundo que surgem a partir da wavefront impurezas na fonte de excitação e podem prejudicar a capacidade de encontrar o avião de imagem correto. Subtração de wavefront ativo é uma maneira útil para contornar este problema e posteriormente monitorar o foco de iSCAT durante uma medição16. Uma maneira de conseguir isso é através de modulação espacial da amostra. Em breve, um gerador de função se aplica a uma onda quadrada de 50 Hz à porta de controle externo do palco piezo, resultando em uma modulação espacial amostra na frequência aplicada (amplitude de 290 nm). Aquisições de câmera síncronas são acionadas da mesma fonte e, quando combinados através de bloqueio-em princípios, resultam em uma compensação de wavefront imagem14,16. A imagem resultante normalmente mostra a aspereza de superfície da lamela (Figura 4e). Pequenos recursos restantes no vidro, após a limpeza podem ser usados para trazer o microscópio em foco. Parâmetros usados para esta etapa de subtração de fundo ativo podem ser alterados de acordo com a taxa de quadros, tempo de exposição ou hardware.
Como mencionado acima, recomenda-se o uso de um divisor de feixe de alta qualidade na configuração do iSCAT (passo 1.2.1.), como de imagem artefatos como fantasmas ou interferências decorrentes de divisores de feixe fino planar irão influenciar a imagem e perturbar a medição. A Figura 7 mostra uma comparação entre um divisor de feixe de alta qualidade e baixa qualidade. Ambas as imagens raw iSCAT mostram a mesma área na lamela contendo algumas partículas residuais. A mesma configuração de iSCAT foi usada para capturar as duas imagens, foi trocado apenas o divisor de feixe. Figura 7a mostra a imagem formada na câmara pelo uso de um mais grosso (5mm), divisor de feixe AR-revestido e comido. Devido ao projeto vendendores, da superfície traseira do divisor de feixe, o feixe reflectido é antiparalelo para a reflexão resultantes da superfície frontal e não está entrando o objetivo. Não há artefatos de interferência ocorrem. Figura 7b mostra o mesmo campo de visão sobre a amostra, mas desta vez um divisor de feixe planar mais fino (1 mm) foi usado. As duas reflexões das superfícies frontais e traseiras do divisor de feixe são paralelas e se propagam para a câmera. Artefatos de interferência são claramente visíveis.
Figura 7: comparação de imagens de iSCAT produzidos com divisores de feixe de alta e baixa-qualidade. (a) resultante iSCAT crua imagem pelo uso de um divisor de feixe grosso, AR-revestido e vendendores de 5 mm. (b) resultando cru iSCAT imagem da mesma área pelo uso de um divisor de feixe planar espessura de 1 mm. Ambos os divisores de feixe têm a mesma proporção de divisão (reflexão de 50%, 50% de transmissão). Artefatos de interferências decorrentes de reflexões de Fresnel são claramente observados na imagem produzida com o divisor de feixe planar espessura de 1 mm. Escala de barras: 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Neste protocolo, descrevemos um esquema de iluminação de campo amplo para iSCAT… como ele é rápido, fácil de perceber e permite a detecção paralela sobre uma grande área de14. Outra abordagem comum é usar defletores Acusto-óptica (AODs) e um feixe confocal de varredura ao longo da amostra de12,17. Essa abordagem evita a necessidade de alta qualidade wavefronts mas é experimentalmente mais complexa do que a convencional de imagem de campo amplo. Além disso, a velocidade de iluminação confocal é limitada pelo de nível. Dependendo dos parâmetros experimentais desejados, ou esquemas de iluminação confocal ou campo amplo podem, em princípio, ser utilizadas para detectar proteínas única secretadas de células vivas.
Conforme discutido em todo o protocolo, é imperativo minimizar flutuações mecânicas laterais na fase de amostra do microscópio. Mesmo nanômetros desvios na posição da amostra podem conduzir a variações nos quadros consecutivos de câmera e induzir ruído externos significativos na imagem diferencial. Portanto, é recomendável usar um palco de microscópio mecanicamente estável e uma tabela de óptica amortecida (etapa 1.1.1.) e para cobrir a instalação com cortinas ópticas ou painéis durante um experimento (passo 3.5.).
Um esquema de estabilização do foco ativo também pode ser considerado para medições de longo prazo. Nessa abordagem, um segundo laser é incorporado ao microscópio em um arranjo de reflexão interna total (TIR) e posteriormente fotografado para um fotodíodo de quadrante. Mudanças no foco do sistema traduzem em deslocamentos laterais do laser TIR no diodo quadrante, o que pode ser usado em um loop de feedback activo para controlar o eixo z de piezo palco26local. Efeitos a longo prazo da tração vertical, portanto, são eliminados.
Várias modificações e extensões podem ser aplicadas para a técnica apresentada para enfrentar as necessidades experimentais específicos. Por exemplo, incubadoras de nível microscópio comercial estão disponíveis que pode facilmente ser incorporada o microscópio de iSCAT para a imagem latente a longo prazo das células. Outras técnicas também podem ser implementadas para complementar a iSCAT de imagem, tais como confocal ou TIR fluorescência microscopies17. Para adaptar o sistema sob estudo, secreção de iSCAT podem ser efectuadas medições em outros meios de célula como DMEM ou DPBS, no entanto, o vermelho de fenol do indicador de pH devem ser evitado como isso pode perturbar o experimento devido à absorção da luz do laser. Além disso, suplementos como soro fetal bezerro (FCS) ou plaquetária humana lisada (hPL) contêm proteínas que podem interferir com a deteção de iSCAT. Dependendo da sensibilidade desejada do experimento, estes suplementos devem ser excluídos do meio de microscopia.
iSCAT baseia-se na capacidade de uma substância a analisar à luz de dispersão — uma propriedade que é intrínseca a todas as proteínas — e, portanto, é inerentemente inespecífica. Não obstante, algum grau de especificidade é possível como iSCAT sinais escala linearmente com a proteína em massa14,,27,28. Isto permite a calibração de um sistema de iSCAT usando amostras de padrão da proteína, como albumina de soro bovino (BSA) e fibrinogênio14,,27,28. Na verdade, muito recentemente, a jovem et al 28 estenderam-se no trabalho de Piliarik & Sandoghdar14 e mostraram que iSCAT pode ser usado para determinar o peso molecular das proteínas tão pequenas quanto streptavidin (53 kDa) com uma resolução em massa de 19 kDa e uma precisão de cerca de 5 kDa. Várias abordagens convencionais mais podem complementar iSCAT, fornecendo um nível extra de especificidade. Como um exemplo, ensaios imunoenzimático (ELISA), e/ou outras modificações de superfície, restringir a eventos de ligação de proteínas para que somente a proteína alvo é detectado16.
Neste protocolo, descrevemos como microscopia iSCAT pode ser usada para investigar as secreções celulares a nível de proteína única com resolução temporal de subsegundo16. A técnica é geral e pode ser implementada em qualquer microscópio comercial ou construídos em casa. Em contraste com as abordagens de único-molécula fluorescência, o método não sofre fotobranqueamento ou piscar efeitos mas ainda atinge a sensibilidade single-proteína. Estas características fazem de iSCAT, uma ferramenta poderosa no campo da microscopia e biosensing. As aplicações futuras incidirá na elucidação de complexas interacções celulares tais como a resposta imunológica a um estímulo ou a comunicação celular.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela sociedade Max Planck, um cargo de professor de Alexander-von-Humboldt e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Agradecemos a Stefanie Schaffer em Universitätsklinikum Erlangen para fornecer células Laz388 e para debates úteis. Agradecemos a Simone Ihloff e Maksim Schwab em MPL para suporte técnico.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |