Presentamos un protocolo para la detección óptica en tiempo real de las proteínas solo como se secretan de las células vivas. Esto se basa en Microscopia interferométrica dispersión (iSCAT), que puede ser aplicada a una variedad de configuraciones y sistemas biológicos diferentes.
Demostramos la microscopia interferométrica dispersión (iSCAT), un método capaz de detectar proteínas sin etiqueta solo secretadas de las células vivas individuales en tiempo real. En este protocolo, cubrimos los pasos fundamentales para realizar un microscopio iSCAT y complementarlo con otros canales de imágenes para monitorear la viabilidad de una célula bajo estudio. A continuación, utilizamos el método de detección en tiempo real de solo proteínas como son secretadas de una célula viva que nos muestran con una línea de células B inmortalizada (Laz388). Se discuten las medidas necesarias relativas a la preparación del microscopio y muestra, así como el análisis de los datos registrados. El protocolo video demuestra que eso microscopia iSCAT ofrece un método sencillo para estudiar la secreción a nivel de una sola molécula.
Proteínas secretadas juegan un papel importante en varios procesos fisiológicos1. Debido a esto, ellos rutinariamente se estudian como un conjunto colectivo (Proteómica) o como entidades individuales2,3. Proteómica tradicionalmente investiga el conjunto de proteínas presentes en un sistema biológico en particular por ejemplo, los análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), citometría de flujo o espectrometría de masas en4,5, 6. Solo proteínas, por el contrario, son generalmente detectadas usando una variedad de técnicas que se basan en la fluorescencia7,8, plasmónica9,10o criogénico electrónica11 Microscopias. Todas estas técnicas utilizan instrumentos complejos, etiquetado o ambos y con frecuencia carecen de información dinámica que sólo entregan información a largo plazo sobre el sistema bajo estudio.
Aquí usamos iSCAT12,13 microscopia para proteínas secretoras individuales del sentido segundo resolución temporal14. Lo importante, la técnica detecta la débil señal dispersa intrínseca a cada proteína12,14. La cantidad de luz que esparce una bioparticle pequeña escala con su polarizabilidad. Suponiendo que la forma de una proteína se puede aproximar por una dispersión efectiva esfera14,15,16y que diferentes proteínas tienen índices de refracción muy similares, la señal de medición puede ser directamente conectado con el peso molecular (MW) de la proteína. La calibración empírica iSCAT contraste versus peso molecular por medidas de referencia permite distinguir las proteínas de diferentes tamaños. iSCAT experimentos pueden ser fácilmente complementados por microscopia de fluorescencia17,18, immunosorbent reactivos, así como las etiquetas fluorescentes o dispersión para permitir una detección específica de alguna proteína de interés14 , 17 , 19.
En principio, iSCAT funciona amplificando la débil luz dispersada de una proteína mediante interferometría mezclado con una onda de referencia secundario. La intensidad detectada () en un iSCAT microscopio es descrito por
donde es la intensidad incidente,
es un coeficiente para la contribución de la onda de la referencia,
significa la fuerza de dispersión de la nano-objeto de estudio, y
es el desplazamiento de fase entre los dispersos y de referencia olas de14. Ya sea la transmitida o reflejada detrás luz del incidente se utiliza normalmente como una onda de la referencia, donde en cada caso
representa la transmisividad o reflectividad de la cámara de muestra, respectivamente. El término
es proporcional a la sección de dispersión de la proteína y puede ser descuidado en comparación con el término cruzado. Lo,
para interferencia destructiva completa, se da la luz detectada por
donde
es la intensidad de referencia y
es la intensidad de interferencia.
iSCAT microscopia ofrece un excelente método para estudiar los procesos biológicos a nivel de una sola molécula. Por ejemplo, investigamos las células Laz388, un virus de Epstein – Barr (EBV) transformado linfocito B célula línea20,21 — como segregan proteínas como los anticuerpos de IgG16. Sin embargo, el método es general y puede aplicarse a una variedad de otros sistemas biológicos. iSCAT es inherentemente inespecífica y puede detectar cualquier proteína o nanopartículas o puede ser extendido con métodos de funcionalización de superficies comunes para la detección de la específica o multiplexado. Su sencillez y capacidad para ser combinado con otras técnicas ópticas, tales como microscopía de fluorescencia, hacen iSCAT una valiosa herramienta complementaria en biología de la célula.
Uno de los aspectos más importantes para la obtención de datos útiles iSCAT es la habilidad para encontrar la posición focal en la superficie del cubreobjetos y, además, a mantener esta posición por largos períodos de tiempo. No hacerlo resultará en ampliado PSFs, iSCAT débiles señales y artefactos asociados a la deriva en el análisis de la dinámica. Resulta que encontrar el plano focal en un cubreobjetos limpio, pelado superficie no es tarea fácil como características superficiales no son visibles contra el fondo de viga de gran referencia (ver figura 4 d).
ISCAT crudas imágenes son a menudo oscurecidas por las señales de fondo que surgen de las impurezas de frente de onda en la fuente de excitación y pueden dificultar la capacidad de encontrar el plano de proyección de imagen correcto. Resta de activo frente de onda es una forma útil para eludir esta cuestión y posteriormente controlar el foco de la iSCAT durante una medida16. Una manera de lograrlo es a través de la modulación espacial muestra. En Resumen, un generador de funciones aplica una onda cuadrada de 50Hz al puerto de control externo de la etapa de piezoeléctrica, lo que resulta en una modulación espacial muestra a la frecuencia aplicada (amplitud de 290 nm). Adquisiciones de cámara sincrónica se activan de la misma fuente y, cuando se combinan a través del bloqueo de principios, dan como resultado una imagen compensada de frente de onda14,16. La imagen resultante muestra típicamente la rugosidad de la superficie del cubreobjetos (Figura 4e). Pequeñas características que queda en el vidrio después de la limpieza pueden utilizarse para poner el microscopio en foco. Parámetros utilizados para esta etapa de sustracción de fondo activo pueden cambiarse según la velocidad de fotogramas, tiempo de exposición o hardware.
Como se mencionó anteriormente, se recomienda el uso de un divisor de haz de alta calidad en la configuración de la iSCAT (paso 1.2.1.), como de artefactos como fantasma o interferencias derivadas de divisores de viga plana fina que influyen en la imagen y perturbar la medición. La figura 7 muestra una comparación entre un divisor de haz de alta calidad y baja calidad. Ambas imágenes raw iSCAT muestran la misma área en el cubreobjetos con algunas partículas residuales. La misma configuración de la iSCAT fue utilizada para capturar ambas imágenes, sólo el divisor de viga fue intercambiado. La Figura 7a muestra la imagen formada en la cámara por medio de una más gruesa (5 mm), divisor de haz cubierto AR y cuña. Debido al diseño de la cuña, el rayo reflejado de la superficie posterior del divisor de haz es el paralelo a la reflexión de la superficie frontal y no entra en el objetivo. No hay artefactos de interferencia se producen. Figura 7b muestra el mismo campo de vista en la muestra, pero esta vez se utilizó un divisor de viga plana más fino (1 mm). Los dos reflejos de las superficies frontales y posterior del divisor de viga son paralelos y propagan a la cámara. Artefactos de interferencia son claramente visibles.
Figura 7: comparación de imágenes de la iSCAT produjo con divisores de haz de alta y baja calidad. (a) resultando iSCAT cruda imagen por medio de un divisor de viga de espesor recubierto de AR y cuña de 5 mm. (b) resultando iSCAT cruda imagen de la misma zona por el uso de un divisor de viga plana gruesa 1 mm. Ambos divisores de viga tienen la misma relación de división (reflexión del 50%, 50% de transmisión). Artefactos de interferencia de reflexiones de Fresnel se observan claramente en la imagen con el divisor de viga plana gruesa de 1 mm. Barras de escala: 2 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En este protocolo se describe un esquema de iluminación de gran campo para iSCAT ya que es rápido, fácil de realizar y permite la detección paralela sobre un área grande14. Otro enfoque común es utilizar deflectores de acusto-óptica (AODs) y una viga confocal de la exploración a través de la muestra12,17. Este enfoque evita la necesidad de frentes de onda de alta calidad pero es más experimental complejo convencional proyección de imagen de gran campo. Además, la velocidad de iluminación confocal está limitada por la de AODs. Dependiendo de los parámetros experimentales deseados, ya sea esquemas confocal o gran campo de iluminación, en principio, se pueden utilizar para detectar solo proteínas segregadas de las células vivas.
Como se explica en el protocolo, es imperativo para reducir al mínimo las fluctuaciones mecánicas laterales en la etapa de muestra del microscopio. Incluso nanómetros desviaciones en la posición de la muestra pueden conducir a variaciones en los marcos de cámara consecutivos e inducir significativos ruidos extraños en la imagen diferencial. Por lo tanto se recomienda utilizar una platina del microscopio mecánicamente estable y una mesa óptica amortiguada (paso 1.1.1.) y realizar la configuración con paneles o cortinas ópticos durante un experimento (paso 3.5.).
También podría considerarse un esquema de estabilización foco activo para mediciones a largo plazo. En este enfoque, un segundo láser es incorporado en el microscopio en un arreglo de reflexión interna total (TIR) y posteriormente reflejado en un fotodiodo de cuadrante. Cambios en el enfoque del sistema se traducen en desplazamientos laterales TIR del laser de la mancha en el diodo del cuadrante, que luego puede utilizarse un lazo de regeneración activa para controlar el eje z del piezo etapa26. Así se eliminan los efectos a largo plazo de la deriva vertical.
Varias modificaciones y extensiones pueden aplicarse a la técnica presentada a necesidades experimentales específicas de dirección. Por ejemplo, incubadoras de etapa del microscopio comerciales están disponibles que podrían incorporarse fácilmente en el microscopio de la iSCAT para la proyección de imagen a largo plazo de las células. También se pueden implementar otras técnicas para complementar iSCAT la proyección de imagen, tales como confocal o TIR de Microscopías de fluorescencia17. Para adaptar el sistema bajo estudio, iSCAT secreción las mediciones pueden realizarse en otros medios celulares como DMEM o DPBS, sin embargo, el indicador de pH rojo de fenol debe evitarse ya que puede perturbar el experimento de debido a la absorción de la luz laser. Además, los suplementos como suero fetal de ternero (FCS) o lisado de la plaqueta humana (hPL) contienen proteínas que pueden interferir con la detección de la iSCAT. Dependiendo de la sensibilidad deseada del experimento, estos suplementos deben ser excluidos del medio de la microscopia.
iSCAT depende de la capacidad de un analito a la luz de dispersión — una propiedad que es intrínseca a todas las proteínas y por lo tanto es inherentemente inespecífica. Sin embargo, algún grado de especificidad es posible como iSCAT señales escala linealmente con proteína total14,27,28. Esto permite la calibración de un sistema de la iSCAT con muestras estándar de proteínas, como albúmina sérica bovina (BSA) y fibrinógeno14,27,28. De hecho, hace muy poco, joven et al. 28 han extendido el trabajo de Piliarik & Sandoghdar14 y han demostrado que iSCAT puede utilizarse para determinar el peso molecular de proteínas tan pequeños como estreptavidina (53 kDa) con una resolución total de 19 kDa y una precisión de cerca de 5 kDa. Varios enfoques convencionales pueden complementar otros iSCAT proporcionando un nivel de especificidad. Como un ejemplo, los análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) y otras modificaciones de superficie, restringen proteínas vinculantes eventos para que sólo la proteína de la blanco es detectan16.
En este protocolo, hemos descrito cómo iSCAT microscopia se puede utilizar para investigar secreciones celulares a nivel de proteína solo con subsegundos resolución temporal16. La técnica es general y puede aplicarse en cualquier microscopio comercial o de fabricación casera. En contraste con los enfoques de una sola molécula de la fluorescencia, el método no sufre de fotoblanqueo o intermitente efectos pero alcanza sensibilidad de solo proteína. Estas características hacen iSCAT una poderosa herramienta en el campo de biodetección y microscopía. Futuras aplicaciones se centrarán en dilucidar las complejas interacciones celulares como respuesta inmunológica a un estímulo o la comunicación celular.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la sociedad Max Planck, una Cátedra de Alejandro de Humboldt y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Agradecemos a Stefanie Schaffer en Universitätsklinikum Erlangen células Laz388 y para las discusiones útiles. Agradecemos a Simone Ihloff y Maksim Schwab en MPL para soporte técnico.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |