इस कागज बेमिसिया टेबासी के लिए एक तेजी से पहचान परख पाश पर आधारित इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (चिराग) प्रौद्योगिकी के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । प्रोटोकॉल ंयूनतम प्रयोगशाला प्रशिक्षण की आवश्यकता है और कर सकते हैं, इसलिए, पर लागू किया जा साइट ऐसे बंदरगाहों और हवाई अड्डों के रूप में संयंत्र के आयात के लिए प्रवेश के अंक पर ।
ह्वाइटफ्लाई बेमिसिया टेबासी (Gennadius) काफी महत्व के एक इनवेसिव कीट है, दुनिया भर के कई देशों में सब्जी और सजावटी फसलों के उत्पादन को प्रभावित । गंभीर उपज नुकसान सीधे खिलाने के कारण होते हैं, और भी अधिक महत्वपूर्ण बात यह भी अधिक से अधिक १०० हानिकारक संयंत्र रोगजनक वायरस के संचरण के द्वारा । अंय इनवेसिव कीट के लिए के रूप में, वृद्धि हुई अंतरराष्ट्रीय व्यापार अपनी मूल सीमा से परे क्षेत्रों को बी टेबासी के फैलाव की सुविधा । ऐसे बंदरगाहों और हवाई अड्डों के रूप में प्रवेश के अंक पर संयंत्र आयात उत्पादों के निरीक्षण कर रहे हैं, इसलिए, एक महत्वपूर्ण रोकथाम के उपाय के रूप में देखा । हालांकि, कीट हमलों के खिलाफ रक्षा के इस अंतिम पंक्ति केवल प्रभावी है अगर संदिग्ध कीट नमूनों के लिए तेजी से पहचान के तरीके आसानी से उपलब्ध हैं । क्योंकि विनियमित B. टेबासी और संगरोध स्थिति के बिना निकट रिश्तेदारों के बीच रूपात्मक भेदभाव गैर वर्गीकरण के लिए मुश्किल है, एक तेजी से आणविक पहचान परख पाश के आधार पर-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन ( लैंप) तकनीक विकसित की गई है । इस प्रकाशन उपंयास परख के विस्तृत प्रोटोकॉल तेजी से डीएनए निष्कर्षण, सेट दीपक प्रतिक्रिया के ऊपर का वर्णन है, साथ ही साथ इसकी व्याख्या को पढ़ने के बाहर है, जो एक घंटे के भीतर बी टेबासी नमूनों की पहचान की अनुमति देता है की रिपोर्ट । विशिष्ट बी टेबासी के पता लगाने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल की तुलना में, विकसित विधि एक परख में पूरे टेबासी प्रजातियों परिसर लक्ष्य । इसके अलावा परख के लिए पर लागू होने के लिए डिज़ाइन किया गया है संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षकों द्वारा ंयूनतम प्रयोगशाला प्रशिक्षण के साथ सीधे प्रवेश के अंक पर । पूरी तरह से मांयता प्रयोगशाला के तहत प्रदर्शन किया और साइट पर शर्तों को दर्शाता है कि रिपोर्ट दीपक परख एक तेजी से और विश्वसनीय पहचान उपकरण है, टेबासी के प्रबंधन में सुधार ।
ह्वाइटफ्लाई बेमिसिया टेबासी (Gennadius) एक इनवेसिव कीट सजावटी पौधों, सब्जियों, अनाज फलियां, और कपास1,2सहित कई आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों की उपज को प्रभावित कीट है । इसके अलावा प्रत्यक्ष फ्लोएम के माध्यम से की वजह से नुकसान खिला, homopteran प्रजातियों के पत्तों और फलों की सतहों पर हनीड्यू की बड़ी मात्रा के उत्सर्जन से अप्रत्यक्ष रूप से पौधों को नुकसान पहुंचाता है, साथ ही साथ कई संयंत्र रोगजनक वायरस1 के संचरण द्वारा , 3 , 4. हाल ही में आनुवंशिक mitochondrial जीन cytochrome सी oxidase 1 (सीओआई) के डीएनए दृश्यों की तुलना अध्ययनों से पता चला है कि बी टेबासी एक प्रजाति के जटिल है कम से ३४ morphocryptic प्रजातियों3,4। इस परिसर में दो अत्यधिक इनवेसिव और हानिकारक सदस्य, मध्य पूर्व और एशियाई लघु क्षेत्र, साथ ही साथ के रूप में अच्छी तरह से भूमध्य क्षेत्र से उद्भव क्ष प्रकार, अंतरराष्ट्रीय व्यापार के माध्यम से विश्व स्तर पर फैलाया गया है । संयंत्र उत्पादों के साथ गतिविधियों, विशेष रूप से टूम1,5,6के परिवहन द्वारा । अपनी दुनिया भर में कीट की स्थिति के कारण, प्रकृति और प्राकृतिक संसाधनों के संरक्षण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संघ (आईयूसीएन) सूचीबद्ध B. टेबासी “दुनिया के १०० सबसे आक्रामक विदेशी प्रजातियों में से एक के रूप में” और प्रजातियों के परिसर के सदस्यों द्वारा विनियमित जीवों हैं कई देशों1,3,4।
यूरोपीय संघ (ईयू) में, B. टेबासी संयंत्र स्वास्थ्य निर्देश 2000/29/चुनाव आयोग अनुलग्नक 1AI में गैर यूरोपीय संघ के देशों और यूरोपीय संघ के भीतर इसके प्रसार से एक संगरोध जीव जिसका परिचय के रूप में सूचीबद्ध है4पर प्रतिबंध लगा दिया । संगरोध जीवों के प्रसार के खिलाफ एक आवश्यक रोकथाम उपाय (पोएस) हवाई अड्डों और बंदरगाहों7,8के रूप में प्रवेश के अंक पर संयंत्र लदान का निरीक्षण है । मामले में एक संगरोध जीव पाया जाता है, राष्ट्रीय संयंत्र संरक्षण संगठन (NPPO) आरोप में या तो खारिज या उपचार (विनाश सहित) द्वारा कार्रवाई लेता है पीड़ित लदान9। हालांकि, अधिकारियों के आयात का निरीक्षण अक्सर वर्गीकरण विशेषज्ञता को सही ढंग से कीट प्रजातियों के विश्व व्यापार9के साथ जुड़े की विशाल रेंज की पहचान नहीं है । विशेष रूप से अपरिपक्व जीवन चरणों की पहचान (जैसे, अंडे और लार्वा) अलग रूपात्मक कुंजी के बिना गैर के लिए लगभग असंभव है वर्गीकरण8,9,10। नतीजतन, ंयूनतम देरी के साथ संगरोध उपायों के कार्यांवयन को सक्षम करने के लिए, वहां विकल्प के लिए एक की जरूरत है, पर तेजी से साइट पहचान परख9।
एक उंमीदवार विधि पाश मध्यस्थता इज़ोटेर्माल डीएनए प्रवर्धन (लैंप) तकनीक है कि हाल ही में संयंत्र रोगजनकों की पहचान के लिए एक उपयुक्त प्रौद्योगिकी हो दिखाया गया है11,12,13। दीपक अत्यधिक विशिष्ट है क्योंकि विधि छह अलग डीएनए लक्ष्य14दृश्यों को पहचानने कम दो प्राइमरी जोड़े का उपयोग करता है । Bst डीएनए पोलीमरेज़ के डीएनए किनारा विस्थापन गतिविधि के कारण, दीपक प्रतिक्रियाओं इज़ोटेर्माल शर्तों के तहत किया जाता है14. इसलिए, पारंपरिक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के विपरीत-परख के आधार पर वहां एक थर्मल साइकिल चालक13,14के लिए कोई ज़रूरत नहीं है । पीसीआर पर एक और लाभ आधारित परख डीएनए निकालने में संभावित अवरोधकों के खिलाफ अपने लचीलापन है, एक डीएनए शुद्धीकरण13कदम की जरूरत को दरकिनार । प्रोटोकॉल की गति और सादगी के कारण, दीपक भी एक पोर्टेबल, बैटरी संचालित वास्तविक समय का पता लगाने डिवाइस8,15का उपयोग कर साइट पर शर्तों के तहत किया जा सकता है ।
एक चिराग परख टेबासी8के लिए एक पर तेजी से साइट पहचान विधि के लिए मांग के जवाब में बनाया गया था । व्यापक उद्देश्य के लिए एक प्रोटोकॉल है कि संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षकों द्वारा सीमित प्रयोगशाला प्रशिक्षण के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है विकसित किया गया था । एक मजबूत ध्यान केंद्रित किया गया था, इसलिए, गति और प्रोटोकॉल की सादगी के अनुकूलन पर सेट । जबकि मौजूदा नैदानिक परीक्षणों में आम तौर पर टेबासीके एक या कई प्रकार की पहचान के लिए विकसित किया गया है, उपंयास लैंप परख पूरे टेबासी प्रजातियों परिसर8,16,17 शामिल ,18. स्पष्ट आनुवंशिक के भीतर taxon विविधता की समस्या परिसर के विभिंन प्राइमर सेट के संयोजन का उपयोग करके हल किया गया था और पतित प्राइमर8के आवेदन । उपंयास बी टेबासी दीपक परख इस तरह से है कि प्राइमरों mitochondrial सीओआई8जीन के 3 ‘ अंत में एक टुकड़ा लक्ष्य में बनाया गया है । यह जीन पशु नैदानिक परख के लिए एक उपयुक्त लक्ष्य प्रस्तुत करता है क्योंकि यह क्षेत्रों बंदरगाहों पर्याप्त एक विशिष्ट प्रजातियों के लिए नैदानिक संवेदनशीलता को सुनिश्चित करने के लिए संरक्षित है, जबकि काफी निकट संबंधित जीवों19के बीच भेदभाव, 20. इसके अलावा, सीओआई जीन अक्सर जनसंख्या आनुवंशिक अध्ययन में एक आनुवंशिक मार्कर के रूप में और डीएनए barcoding विश्लेषण में एक हस्ताक्षर अनुक्रम के रूप में प्रयोग किया जाता है, खुले स्रोत डेटाबेस में कई डीएनए अनुक्रम प्रविष्टियों में ऐसे GenBank और बोल्ड 21 के रूप में जिसके परिणामस्वरूप ,22. इसके अलावा टेबासीसे सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सीओआई अनुक्रम, बारीकी से संबंधित प्रजातियों से सीओआई अनुक्रम (Aleurocanthus एसपीपी. [n = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, बेमिसिया एसपीपी. [n = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes बबूल, और Trialeurodes एसपीपी. [N = 4]) इस अध्ययन के प्राइमर डिजाइन में शामिल किए गए थे और silico8 में नैदानिक संवेदनशीलता और विशिष्टता का आकलन करते थे .
विधि की सटीकता के कारण, इसकी गति (< 1 h) और प्रोटोकॉल की सादगी, परख के लिए साइट पर आवेदन जब एक स्विस पो8पर आयात नियंत्रण प्रक्रिया के भाग के रूप में लागू करने के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया है ।
सही समय देरी के बिना संभावित हानिकारक जीवों की पहचान करने की क्षमता कीट प्रजातियों9,10,26के प्रबंधन के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा तेजी से किया जा रहा है, संयंत्र आयात उत्पादों के लिए, एक आदर्श कीट पहचान विधि पर प्रदर्शन करने के लिए सरल होना चाहिए-पोएस8,26पर साइट । यह कागज बी टेबासी, एक संगरोध कीट अक्सर यूरोपीय सीमाओं पर बाधित जीव की तेजी से पहचान के लिए एक उपंयास दीपक परख के प्रोटोकॉल की रिपोर्ट (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual-report _2016. pdf).
नैदानिक परीक्षण के विकास के पीछे तर्क के लिए एक आसान-प्रोटोकॉल का पालन करें, जो संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षकों द्वारा संयंत्र आयात नियंत्रण प्रक्रिया के दौरान किया जा सकता है ंयूनतम प्रयोगशाला प्रशिक्षण के साथ डिजाइन किया गया था । आदेश में साइट पर परीक्षण करने के रूप में तेजी से और संभव के रूप में सरल, प्रोटोकॉल दो भागों में विभाजित है, तैयार करने के लिए उपयोग किट और दीपक परख के वास्तविक प्रदर्शन की तैयारी । पहला भाग एक बाहरी प्रयोगशाला में किया जा सकता है ताकि संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षक डीएनए निष्कर्षण और दीपक परख पर साइट पर प्रदर्शन कर सकते है केवल एक ही pipetting कदम के साथ ।
हालांकि केवल एक कदम, तरल की छोटी मात्रा pipetting कम या कोई प्रयोगशाला अनुभव के साथ उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस समस्या को हल करने के लिए, एक डाई (cresol लाल) निष्कर्षण समाधान करने के लिए जोड़ा जाता है ताकि ऑपरेटर नेत्रहीन छोटी राशि की पुष्टि कर सकते हैं (यानी, डीएनए की २.५ µ एल) सही ढंग से संबंधित ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है. प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण सरलीकरण मांयता आवेदन के रूप में यह दीपक की एक विश्वसनीय व्याख्या की सुविधा है पढ़ें बाहर (पूरक फ़ाइल 1) ।
उपंयास बी टेबासी दीपक परख प्रयोगशाला और पर साइट के तहत मांयता दी गई है कीट8स्विट्जरलैंड के नियमित रूप से आयात नियंत्रण प्रक्रिया के दौरान बाधित नमूनों का परीक्षण करके । कुल में, तीन महाद्वीपों, अफ्रीका, यूरेशिया, और उत्तरी अमेरिका से ८० नमूनों, दीपक द्वारा विश्लेषण किया गया । ८० नमूनों में से, केवल तीन (३.८%) थे गलत पहचान (झूठी नकारात्मक)8। झूठे-नकारात्मक नमूनों के प्राइमरी टारगेट डीएनए जुगाड़ का विश्लेषण करते समय यह पाया गया कि वे नए बी. टेबासी haplotypes थे जो अब तक८नहीं बताए गए हैं. इन परिणामों के आधार पर, B. टेबासी लैंप प्राइमर सेट संशोधित किया गया है और8सफलतापूर्वक पुन: मान्य ।
किसी भी डीएनए प्रवर्धन की एक प्रमुख सीमा-दीपक सहित विधि आधारित है कि वे केवल पूर्व की पहचान परिभाषित लक्ष्य डीएनए8,27अनुक्रम । प्राइमरी लक्ष्य अनुक्रम में पाए जाने वाले आनुवंशिक रूपांतर का एक व्यापक ज्ञान इसलिए8,27नैदानिक शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, इस तरह की जानकारी अक्सर बहुत सीमित है, विशेष रूप से नए उभरते कीट प्रजातियों8के मामले में । हालांकि दुर्लभ, झूठी-नकारात्मक परिणाम लक्ष्य अनुक्रम में उत्परिवर्तनों की वजह से8उंमीद कर रहे हैं । वर्तमान टेबासी दीपक परख, इस समस्या के लिए एक समाधान के मामले में एक डीएनए barcoding आधारित प्रौद्योगिकी के साथ संयोजन है, एक रणनीति पो ज्यूरिख हवाई अड्डे पर इस नैदानिक परीक्षण के कार्यांवयन के पाठ्यक्रम में महसूस किया8। यहां, सभी लैंप-नकारात्मक परिणाम एक बाहरी प्रयोगशाला8में डीएनए barcoding द्वारा फिर से विश्लेषण किया गया । मामले में एक उपंयास कीट अभी तक वर्णित नहीं haplotype का सामना करना पड़ा है, चिराग प्राइमरों barcoding प्रक्रिया8में उत्पंन डीएनए अनुक्रम का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है । इस प्रकार, एक नकारात्मक लैंप परिणाम के मामले में गति के परिणामस्वरूप नुकसान अधिकतम निदान इस दो चरण प्रक्रिया8में सुनिश्चित सटीकता के लिए क्षतिपूर्ति है ।
सेट अप एक पो पर वर्तमान लैंप परख के लिए लागत लगभग USD २५,००० हैं । दीपक परीक्षणों की बढ़ती संख्या के साथ संयंत्र कीट के लिए विकसित (जैसे, Erwinia amylovora, Flavescence dorée, और Guignardia citricarpa), इस तरह के एक बार निवेश उचित13,15 प्रतीत होता है, 28. हालांकि, प्रोटोकॉल संभावित रूप से आगे भी इन लागत को कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, डीएनए निष्कर्षण चरण के लिए ९५ ° c यहां इस्तेमाल किया थर्मामीटर मिक्सर एक कम महंगा पानी स्नान के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, या वास्तविक समय लैंप डिवाइस में सीधे इस कदम के प्रदर्शन से । इसके अलावा, भंवर पर मिश्रण कदम शायद मैन्युअल ट्यूबों झाड़ना द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और डीएनए हस्तांतरण कदम में pipettor बाँझ टीका छोरों की जगह हो सकती है.
टेबासी और सामांय में कीट प्रजातियों की एक तेजी से पहचान के लिए भविष्य में सुधार एक पर साइट अनुक्रमण दृष्टिकोण है कि पोएस पर डीएनए barcoding विश्लेषण करने की अनुमति होगी के एक कार्यांवयन हो सकता है । इस तरह के एक कार्यांवयन के लिए एक होनहार उंमीदवार प्रणाली ट्विटर अनुक्रमण प्रौद्योगिकी है । दरअसल, प्रौद्योगिकी हाल ही में सफलतापूर्वक एक पर साइट डीएनए barcoding के लिए एक rainforest8,29,30की जैव विविधता का आकलन प्रयास में कार्यांवित किया गया है । एक पर साइट डीएनए barcoding पहचान प्रणाली पूरी तरह से लक्षित नैदानिक परीक्षणों और उनके सत्यापन के विकास के लिए की जरूरत को बदल सकते हैं । इसके अलावा यह कीटनाशक प्रतिरोध जीन8के रूप में कीट विशेषताओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी इकट्ठा करने की अनुमति देता है । फिर भी, जब तक उपंयास अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों नियमित रूप से लागू किया जाएगा, B. टेबासी लैंप परख एक तेजी से (< 1 ज) और सटीक पहचान विधि का प्रतिनिधित्व करता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia घुड़साल, डैनियल Frei, Elisabeth रज़ावी, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun, और स्वेन Moeller के सत्यापन में भाग लेने के लिए टेबासी दीपक परख के लिए आभारी हैं ।
B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |