Kvantitativ Autoradiographic metode for fastsettelse av regionale priser på cerebral protein syntese in vivo
Summary
Proteinsyntese er en kritisk biologisk prosess for celler. I hjernen er det nødvendig for adaptive endringer. Måling av utbredelsen av proteinsyntese i intakt hjernen krever nøye metodisk betraktninger. Her presenterer vi L-[1-14C]-leucine kvantitative autoradiographic metode for bestemmelse av regionale utbredelsen av cerebral protein syntese in vivo.
Abstract
Proteinsyntese er nødvendig for utvikling og vedlikehold av neuronal funksjon og er involvert i adaptive endringer i nervesystemet. Videre er det antatt at feilregulering av proteinsyntese i nervesystemet kan være en kjerne fenotype i noen utviklingsmessige lidelser. Nøyaktig måling av utbredelsen av cerebral proteinsyntese i dyremodeller er viktig for å forstå disse lidelsene. Metoden som vi har utviklet var designet for å brukes til studiet av våken, oppfører dyr. Det er en kvantitativ autoradiographic metode, slik at den kan gi priser i alle regioner av hjernen samtidig. Metoden er basert på bruk av en Tracer aminosyre, L-[1-14C]-leucine, og en kinetisk modell av oppførselen til L-leucine i hjernen. Vi valgte L-[1-14C]-leucine som Tracer fordi den ikke fører til overflødig merket metabolske produkter. Det er enten innlemmet i protein eller raskt metaboliseres til å gi 14co2 som er fortynnet i en stor pool av umerkede co2 i hjernen. Metoden og modellen også tillate for bidrag av umerkede leucine avledet fra vev proteinolyse til vevet forløper for proteinsyntese. Metoden har romlig oppløsning for å bestemme proteinsyntese i celle-og neuropil lag, samt hypothalamus og skallen nerve kjerner. For å oppnå pålitelige og reproduserbar kvantitative data, er det viktig å følge prosessuelle detaljer. Her presenterer vi detaljerte prosedyrer for den kvantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine metode for fastsettelse av regionale utbredelsen av proteinsyntese i vivo.
Introduction
Proteinsyntese er en viktig biologisk prosess som kreves for langsiktig adaptiv endring i nervesystemet1. Hemme proteinsyntese blokker lang tids minne lagring i både virvelløse dyr og virveldyr2. Proteinsyntese er viktig for vedlikehold av de sene fasene av noen former for langsiktig potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD)3, neuronal overlevelse under utbygging4, og for generell vedlikehold av Nevron og dens Synaptic tilkoblinger5. Måling av utbredelsen av hjernen proteinsyntese kan være et viktig verktøy som å studere adaptive endringer samt neurodevelopmental lidelser og lidelser knyttet til læring og hukommelse.
Vi har utviklet en metode for å kvantifisere utbredelsen av cerebral protein syntese in vivo i en våken dyr som tilbyr iboende fordeler fremfor andre teknikker som anslår priser i ex vivo eller in vitro forberedelser av hjernevevet6. Fremst er anvendelsen til målinger i intakt hjernen i et våken dyr. Dette er en viktig faktor fordi den tillater målinger med Synaptic struktur og funksjon på plass og uten bekymringer om etter obduksjon effekter. Videre, den kvantitative autoradiographic tilnærmingen som vi ansetter oppnår en høy grad av romlig lokalisering. Mens energien på 14C er slik at vi ikke kan lokalisere Tracer på subcellulære eller cellenivå, kan vi måle priser i celle lag og små hjerneområder som hypothalamus kjerner, med omtrent en 25 μm oppløsning7.
En utfordring av in vivo målinger med radiotracers er å sikre at radiolabel målt er i produktet av reaksjonen av interesse i stedet for ureagerte merket forløper eller andre overflødige merkede metabolske produkter6. Vi valgte L-[1-14C]-leucine som Tracer amino acid fordi det er enten innlemmet i protein eller raskt metaboliseres til 14co2, som er fortynnet i det store bassenget av umerkede co2 i hjernen som følge av høy hastighet på energi metabolisme8. Videre, noen 14c ikke innlemmet i protein eksisterer først og fremst som fri [14C]-leucine, som over 60 min eksperimentelle perioden, er nesten helt ryddet fra vevet6. Proteiner blir deretter festet til vev med formalin og deretter skylles med vannet fjerne eventuelle fri [14C]-leucine før autoradiografi.
En annen viktig faktor er spørsmålet om fortynning av den spesifikke aktiviteten av forløperen aminosyre pool av umerkede aminosyrer avledet fra vev proteinolyse. Vi har vist at i voksen rotte og mus, ca 40% av forløperen leucine pool for proteinsyntese i hjernen kommer fra aminosyrer avledet fra protein sammenbrudd6. Dette må inkluderes i beregningen av regionale utbredelsen av cerebral proteinsyntese (rCPS) og må bekreftes i studier der dette forholdet kan endres. Det teoretiske grunnlaget og forutsetningene for metoden har blitt presentert i detalj andre steder6. I denne utredningen fokuserer vi på de prosessuelle spørsmålene i anvendelsen av denne metodikken.
Denne metoden har vært ansatt for fastsettelse av rCPS i bakken ekorn9, sau10, rhesus Monkeys11, rotter12,13, 14,15,16 , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21, en mus modell av tuberous sklerose kompleks22, en mus modell av skjøre x syndrom23,24,25,26, skjøre x premutation mus27, og en musemodell av Fenylketonuri28. I dette manuskriptet presenterer vi prosedyrene for måling av rCPS med in vivo autoradiographic L-[1-14C]-leucine metode. Vi stede rCPS i hjernen regioner av en våken kontroll musen. Vi viser også at in vivo administrasjon av anisomycin, en hemmer av oversettelsen, opphever proteinsyntese i hjernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer en kvantitativ metode for fastsettelse av regionale utbredelsen av cerebral protein syntese (rCPS) in vivo i forsøksdyr. Denne metoden har betydelige fordeler i forhold til eksisterende metoder: 1. målingene er gjort i våken oppfører dyret, slik at de reflekterer pågående prosesser i fungerende hjernen. 2. målinger er gjort ved hjelp av kvantitative autoradiografi som gir muligheten til å bestemme rCPS i alle regioner og regioner i hjernen samtidig. 3. kinetisk modell av metoden tar hensyn til muli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Zengyan Xia for genotyperingteknologi av mus, tom Burlin for behandling av aminosyrer og filmer, og Mei Qin for å utføre noen av de rCPS eksperimenter. Denne forskningen ble støttet av intramural Research program for NIMH, ZIA MH00889. RMS ble også støttet av en Autism snakker postdoktor Fellowship 8679 og en FRAXA postdoktor Fellowship.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. . Basic Neurochemistry. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
