एक दाद सिंप्लेक्स वायरस के परमाणु-cytoplasmic Translocation के लौकिक विश्लेषण Immunofluorescent फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा 1 प्रोटीन
Summary
एचएसवी-1 संक्रमण के दौरान ICP0 बहोत न्यूक्लियर-टू-cytoplasmic translocation । इस घटना का आणविक तंत्र ज्ञात नहीं है. यहां हम एचएसवी-1 संक्रमण है, जो मात्रात्मक भविष्य में यंत्रवत अध्ययन में ICP0 translocation विश्लेषण के लिए आधार देता है में ICP0 आंदोलन यों तो एक उपकरण के रूप में फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग का वर्णन ।
Abstract
संक्रमित कोशिका प्रोटीन 0 (ICP0) दाद सिंप्लेक्स वायरस 1 (एचएसवी-1) एक अंगूठी प्रकार E3 ubiquitin ligase युक्त तत्काल जल्दी प्रोटीन है । यह मेजबान प्रतिबंधात्मक कारकों और बाद में वायरल जीन सक्रियण के proteasomal क्षरण के लिए जिंमेदार है । ICP0 में एक विहित नाभिकीय स्थानीयकरण अनुक्रम (एनएलएस) होता है । यह तुरंत डी नोवो संश्लेषण के बाद नाभिक में प्रवेश करती है और नाभिक में मुख्य रूप से अपने विरोधी मेजबान रक्षा कार्य निष्पादित करता है । हालांकि, बाद में संक्रमण में, ICP0 केवल कोशिका द्रव्य में पाया जाता है, एचएसवी-1 संक्रमण के दौरान एक परमाणु-cytoplasmic translocation की घटना का सुझाव । शायद ICP0 translocation अलग संक्रमण चरणों में अपने उपसेलुलर स्थानों के अनुसार अपने कार्यों को मिलाना ICP0 सक्षम बनाता है । ICP0 परमाणु-टू-cytoplasmic translocation के जैविक कार्य और विनियामक तंत्र को चित्रित करने के लिए, हमने immunofluorescent-1 संक्रमण के दौरान ICP0 तस्करी पर नजर रखने के लिए एक एचएसवी माइक्रोस्कोपिक पद्धति को संशोधित किया था । इस प्रोटोकॉल immunofluorescent धुंधला, फोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग, और परमाणु बनाम cytoplasmic वितरण विश्लेषण शामिल है । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को स्थिर राज्य फोकल lytic संक्रमण भर में ICP0 आंदोलन के एक मात्रात्मक प्रलेखन में एक समय पाठ्यक्रम में ले लिया छवियों अनुकूलन है । हम प्रस्ताव है कि इस विधि को मात्रात्मक अंय वायरल या सेलुलर प्रोटीन के परमाणु बनाम cytoplasmic स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए लाइव इमेजिंग प्रौद्योगिकी को शामिल किए बिना सामान्यीकृत किया जा सकता है ।
Introduction
दाद सिंप्लेक्स वायरस 1 (एचएसवी-1) दाद labialis, जननांग दाद, stromal स्वच्छपटलशोथ, और इन्सेफेलाइटिस सहित गंभीर ददहा रोगों के लिए हल्के की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बनता है । एक बार संक्रमित, वायरस गैंग्लिया न्यूरॉन्स में एक आजीवन अव्यक्त संक्रमण स्थापित करता है. कभी-कभार, वायरस विभिन्न कारणों से इस तरह के बुखार के रूप में सक्रिय किया जा सकता है, तनाव, और प्रतिरक्षा दमन1, आवर्तक दाद संक्रमण के लिए अग्रणी. संक्रमित सेल प्रोटीन 0 (ICP0) lytic और अव्यक्त एचएसवी-1 संक्रमण दोनों के लिए एक महत्वपूर्ण वायरल नियामक है । यह मेजबान आंतरिक/जन्मजात एंटीवायरल2,3सुरक्षा प्रतिक्रिया के माध्यम से बहाव वायरस जीन transactivates । ICP0 एक E3 ubiquitin ligase गतिविधि है, जो proteasome के लिए कई सेल कारकों पर निर्भर क्षरण3लक्ष्य है । यह भी विभिन्न सेल रास्ते के साथ बातचीत करने के लिए उनकी गतिविधियों को विनियमित करने के लिए और बाद में ऑफसेट करने के लिए मेजबान एंटीवायरल प्रतिबंध3. ICP0 अलग उपसेलुलर डिब्बों पर संक्रमण आय3,4,5के रूप में पता लगाने के लिए जाना जाता है । प्रोटीन एक lysine/arginine-रिच परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) ५०० ५०६6के अवशेषों पर स्थित है । जल्दी एचएसवी-1 संक्रमण पर डी नोवो संश्लेषण पर, ICP0 तुरंत नाभिक में आयात किया जाता है । यह पहली बार एक गतिशील परमाणु संरचना में पाया जाता है परमाणु डोमेन 10 (ND10) का कार्यकाल7। E3 ubiquitin ligase गतिविधि के ICP0 ट्रिगर ND10 आयोजक प्रोटीन, promyelocytic ल्यूकेमिया (पीएमएल) प्रोटीन का क्षरण, और धब्बेदार प्रोटीन १०० केडीए (Sp100)8,9,10. आयोजक प्रोटीन के नुकसान के बाद, ND10 परमाणु शरीर फैलाया जाता है और ICP0 पूरे नाभिक को भरने के लिए फैलाना है4,11.
दिलचस्प है, वायरल डीएनए प्रतिकृति की शुरुआत के बाद, ICP0 नाभिक से गायब हो जाता है । यह केवल कोशिका द्रव्य में पाया जाता है, एक परमाणु-cytoplasmic translocation देर एचएसवी-1 संक्रमण4,12की घटना का सुझाव । डीएनए प्रतिकृति की आवश्यकता से तात्पर्य है एक देर से वायरल प्रोटीन की क्षमता की भागीदारी (ओं) को सुविधाजनक बनाने में एचएसवी के cytoplasmic translocation-1 ICP04,12। जाहिरा तौर पर संक्रमण के दौरान विभिंन डिब्बों के बीच ICP0 तस्कर ICP0 अधिकार के लिए एक स्थानिक लौकिक फैशन में विभिंन सेलुलर रास्ते के लिए अपनी बातचीत मिलाना, और इसलिए इसके कई कार्यों के बीच संतुलन धुन ठीक करने के लिए समंवय lytic और अव्यक्त एचएसवी-1 संक्रमण13. बेहतर ICP0 multifunctionality और lytic संक्रमण के दौरान ICP0 कार्यात्मक डोमेन के समंवय को समझने के लिए, हम ध्यान से गतिशील ICP0 translocation12के आणविक आधार विदारक । यंत्रवत अध्ययन पहले12की रिपोर्ट का संचालन करने के लिए, हम फोकल माइक्रोस्कोप के तहत विभिन्न संक्रमण की स्थिति में ICP0 उपसेलुलर स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए एक immunofluorescent धुंधला विधि लागू किया है. हम भी एक मात्रात्मक प्रोटोकॉल विकसित किया है ICP0 के परमाणु बनाम cytoplasmic वितरण का विश्लेषण करने के लिए फोकल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । एचएसवी-1 संक्रमित कोशिकाओं की आबादी संक्रमण चरणों भर में सारणीबद्ध और ICP0 आंदोलन की प्रवृत्तियों का विश्लेषण किया गया था, विभिन्न जैव रासायनिक उपचार के तहत12. यहां हम विस्तृत प्रोटोकॉल है कि दस्तावेजों एचएसवी-1 संक्रमण में ICP0 translocation का वर्णन । हम प्रस्ताव है कि इस विधि के लिए एक सामांय विधि के रूप में अपनाया जा सकता है अंय वायरल या सेलुलर प्रोटीन के लिए परमाणु बनाम cytoplasmic translocation अध्ययन, जो इमेजिंग जीने के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते है जब लाइव इमेजिंग तकनीक के कारण लागू है ऐसे लेबलिंग विधि, संकेत तीव्रता, या प्रोटीन बहुतायत के रूप में समस्याओं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एचएसवी-1 ICP0 के न्यूक्लियर-टू-cytoplasmic translocation का अध्ययन करने के लिए किया गया है । एचएसवी-1 संक्रमण (figure 1) के दौरान ICP0 बहोत सेल् फी ्े । संभावना है, ICP0 विभिंन स्थानों पर विभिंन कार्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एक NIH अनुदान (RO1AI118992) Haidong गुजरात को संमानित किया से वित्तीय सहायता का शुक्र है । हम तकनीकी सहायता के लिए वेन स्टेट यूनिवर्सिटी में माइक्रोस्कोपी, इमेजिंग एंड Cytometry रिसोर्स (MICR) कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
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