Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência
Summary
ICP0 sofre translocação nuclear-para-citoplasmática durante a infecção HSV-1. O mecanismo molecular deste evento não é conhecido. Aqui nós descrevemos o uso do microscópio confocal como uma ferramenta para quantificar o movimento de ICP0 na infecção pelo HSV-1, que estabelece as bases para a análise de quantitativamente ICP0 translocação em futuros estudos mecanicistas.
Abstract
Célula infectada proteína 0 (ICP0) de herpes simplex vírus 1 (HSV-1) é uma proteína de início imediata contendo um anel tipo E3 ubiquitina ligase. É responsável pela degradação proteasomal de fatores restritivos do hospedeiro e a ativação do gene viral subsequentes. ICP0 contém uma sequência canônica de localização nuclear (NLS). Ele entra no núcleo imediatamente após a síntese de novo e executa suas funções de defesa do antiprincipalmente hospedeiro no núcleo. No entanto, mais tarde em infecção, ICP0 é encontrada exclusivamente no citoplasma, sugerindo a ocorrência de uma translocação nuclear-para-citoplasmática durante a infecção HSV-1. Presumivelmente ICP0 translocação permite ICP0 modular as suas funções de acordo com sua localização subcellular em fases diferentes de infecção. A fim de delinear a função biológica e mecanismo regulatório de translocação nuclear e citoplasmático ICP0, nós modificamos um método de microscopia de imunofluorescência para monitorar o tráfico de ICP0 durante a infecção HSV-1. Este protocolo envolve a coloração imunofluorescente, microscópio confocal de imagem e nuclear vs citoplasmática análise da distribuição. O objetivo do presente protocolo é adaptar as imagens confocal de estado estacionário, tomadas em um curso de tempo em uma documentação quantitativa do movimento ICP0 em toda a infecção lítica. Propomos que este método pode ser generalizado para analisar quantitativamente nuclear vs localização citoplasmática de outras proteínas virais ou celulares sem envolvendo tecnologia de imagem ao vivo.
Introduction
Herpes simplex vírus 1 (HSV-1) faz com que uma ampla gama de leves a graves doenças herpéticas incluindo herpes labial, herpes genital, ceratite estromal e encefalite. Uma vez infectado, o vírus estabelece uma infecção latente ao longo da vida nos neurônios do gânglio. Ocasionalmente, o vírus pode ser reativado por várias razões, tais como febre, estresse e imunossupressão1, levando a infecção de herpes recorrente. Célula infectada proteína 0 (ICP0) é um regulador de viral chave crucial para a infecção de HSV-1 lítica e latente. -Preferencialmente a jusante vírus genes através de contrariar o anfitrião intrínseco/inata defesas antivirais2,3. ICP0 tem uma atividade de ligase E3 ubiquitina, que tem como alvo a diversos fatores de célula para degradação de proteossomo dependente3. Também interage com várias vias de célula para regular as suas actividades e, posteriormente, para compensar o anfitrião restrições antiviral3. ICP0 é conhecido para localizar em diferentes compartimentos subcellular enquanto a infecção prossegue3,4,5. A proteína tem um sinal de localização nuclear de lisina e arginina-rich (NLS), situado em resíduos 500 para 5066. A síntese de novo no início infecção HSV-1, ICP0 imediatamente é importado para o núcleo. Primeiro é detectado em uma dinâmica nuclear estrutura denominado domínio nuclear 10 (ND10)7. A atividade E3 ubiquitina ligase ICP0 provoca a degradação de proteínas de organizador ND10, promielocítica leucemia (PML) proteína e proteína salpicados 100 kDa (Sp100)8,9,10. Após a perda de proteínas do organizador, ND10 corpos nucleares estão dispersos e ICP0 é difundida para preencher o núcleo inteiro4,11.
Curiosamente, após o início da replicação do DNA viral, ICP0 desaparece a partir do núcleo. Pode ser encontrada exclusivamente no citoplasma, sugerindo a ocorrência de uma translocação nuclear-para-citoplasmática no final de4,de infecção HSV-112. A exigência da replicação de DNA implica o envolvimento potencial de um tarde antisentido viral em facilitar a translocação citoplasmática de HSV-1 ICP04,12. Aparentemente ICP0 tráfico entre diferentes compartimentos durante infecção capacita ICP0 modular suas interações para vários caminhos celulares de forma espaço-temporal, e, portanto, coordenar suas funções múltiplas à multa ajustar o equilíbrio entre o lítico e latente HSV-1 infecção13. Para entender melhor a multifuncionalidade do ICP0 e a coordenação de ICP0 domínios funcionais durante a infecção lítica, dissequei cuidadosamente a base molecular da dinâmica translocação ICP012. Para realizar os estudos mecanicistas anteriormente relatados12, nós aplicamos um método de coloração imunofluorescente para visualizar a Localização subcellular ICP0 no status de infecção diferentes sob microscópio confocal. Também desenvolvemos um protocolo quantitativo para analisar a nuclear vs citoplasmática distribuição de ICP0 usando o software confocal. A população de células infectadas HSV-1 foi tabulada ao longo das fases de infecção e as tendências do movimento de ICP0 foram analisadas, sob diferentes tratamentos bioquímicos12. Aqui descrevemos o protocolo detalhado a translocação de documentos ICP0 em infecção HSV-1. Propomos que este método pode ser adotado como um método geral para estudar a nuclear vs translocação citoplasmática para outras proteínas virais ou celulares, que pode servir como uma alternativa para imagens ao vivo quando a técnica de imagem ao vivo não é aplicável devido a problemas tais como rotulagem método, intensidade de sinal ou abundância de proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo tem sido costumava estudar a translocação nuclear e citoplasmática de HSV-1 ICP0. ICP0 sofre tráfico subcellular durante a infecção HSV-1 (Figura 1). Provavelmente, ICP0 interage com várias vias de célula para realizar diferentes funções em diferentes locais. Isso permite que o ICP0 afinar suas múltiplas funções no cabo de guerra com hospedeiro humano13. No entanto, como ICP0 coordenadas as múltiplas funções de forma espaço-temporal nã…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio financeiro de uma subvenção de NIH (RO1AI118992), atribuído a Haidong Gu. Agradecemos a instalação de microscopia, imagem & Core Cytometry recursos (MICR) Universidade Estadual de Wayne para suporte técnico.
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
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