ICP0 genomgår kärn-till-Cytoplasmatisk translokation vid HSV-1 infektion. Den molekylära mekanismen av denna händelse är inte känd. Här beskriver vi användningen av confocal Mikroskop som ett verktyg för att kvantifiera ICP0 rörelse i HSV-1 infektion, som lägger grunden för kvantitativt analysera ICP0 flyttning i framtida mekanistiska studier.
Infekterad cell protein 0 (ICP0) av herpes simplex virus 1 (HSV-1) är en omedelbar tidiga protein som innehåller en RING-typ E3 ubiquitin ligase. Den ansvarar för proteasomen degraderingen av värd begränsande faktorer och efterföljande viral genen aktivering. ICP0 innehåller en kanonisk cellkärnelokalisering sekvens (NLS). Det in i kärnan omedelbart efter de novo syntes och exekverar dess anti värd försvar funktioner främst i kärnan. Dock senare i infektion finns ICP0 enbart i cytoplasman, vilket tyder på förekomsten av en kärn-till-Cytoplasmatisk flyttning under HSV-1 infektion. Förmodligen kan ICP0 flyttning ICP0 att modulera dess funktioner enligt dess subcellulär platser på olika infektion faser. För att avgränsa den biologiska funktionen och reglerande mekanism av ICP0 kärn-till-Cytoplasmatisk translokation, modifierade vi en Immunofluorescerande mikroskopi metod för att övervaka ICP0 människohandel under HSV-1 infektion. Detta protokoll innebär Immunofluorescerande färgning, confocal Mikroskop imaging, och kärn vs. cytoplasmisk fördelning analys. Målet med detta protokoll är att anpassa steady-state confocal bilder tagna i en dags kurs i en kvantitativ dokumentation av ICP0 rörelse i hela lytisk infektionen. Vi föreslår att denna metod kan generaliseras för att kvantitativt analysera nukleära vs. cytoplasmiska lokalisering av andra virus eller cellulära proteiner utan att involvera levande bildteknik.
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) orsakar ett brett utbud av mild till svår postherpetisk sjukdomar inklusive herpes labialis, genital herpes, stromal keratit och encefalit. När smittade, upprättar viruset ett livslångt latent infektion i ganglier nervceller. Ibland kan viruset reaktiveras av olika skäl såsom feber, stress och immunsystemet1, leder till återkommande herpesinfektion. Infekterad cell protein 0 (ICP0) är en nyckel viral regulator som är avgörande för både lytisk och latent HSV-1 infektion. Det transactivates nedströms virus gener via motverka den värd inneboende/medfödda antivirala försvar2,3. ICP0 har en E3 ubiquitin ligase verksamhet, som riktar sig till flera cell faktorer för proteasom-beroende nedbrytning3. Det samverkar också med olika cell vägar att reglera deras verksamhet och därefter att kompensera värd antivirala begränsningar3. ICP0 är känd för att hitta på olika subcellulär fack som infektionen fortsätter3,4,5. Proteinet har lysin/arginin-rika cellkärnelokalisering signal (NLS) ligger på rester 500 till 5066. Vid de novo syntes på tidiga HSV-1 infektion importeras ICP0 omedelbart in i cellkärnan. Det upptäcks först vid en dynamisk nukleära struktur kallas kärnkraftsområdet 10 (ND10)7. E3 ubiquitin ligase aktiviteten av ICP0 utlöser nedbrytningen av ND10 arrangör proteiner, promyeloisk leukemi (PML) protein och spräckliga protein 100 kDa (Sp100)8,9,10. Efter förlusten av arrangör proteiner, ND10 kärn organ är spridda och ICP0 sprids för att fylla hela kärnan4,11.
Intressant, efter uppkomsten av virala DNA-replikation försvinner ICP0 från kärnan. Det finns enbart i cytoplasman, vilket tyder på förekomsten av en kärn-till-Cytoplasmatisk flyttning sent i HSV-1 infektion4,12. Kravet på den DNA-replikationen innebär potentiella deltagande en sena viral proteinernas att underlätta den cytoplasmiska flyttning av HSV-1 ICP04,12. Tydligen ICP0 människohandel bland olika fack under infektion ger ICP0 att modulera dess interaktioner till olika cellulära vägar i en spatial-temporal mode, och därför samordna dess flera funktioner till fina finjustera balansen mellan lytisk och latent HSV-1 infektion13. För att bättre förstå ICP0 multifunktionalitet och samordning av ICP0 funktionella domäner i hela lytisk infektionen, dissekerade vi noggrant den molekylära basen för den dynamiska ICP0 flyttning12. För att genomföra den mekanistiska studier tidigare rapporterade12, har vi tillämpat en Immunofluorescerande färgningsmetod för att visualisera ICP0 subcellulär lokalisering på olika infektionsstatus confocal Mikroskop. Vi har också utvecklat ett kvantitativa protokoll för att analysera nukleära vs. cytoplasmiska fördelningen av ICP0 med hjälp av confocal programvara. Befolkningen av HSV-1-infekterade celler var i tabellform i hela infektion faser och utvecklingen av ICP0 rörelse analyserades, enligt olika biokemiska behandlingar12. Här beskriver vi de detaljerade protokollet som dokument ICP0 flyttning i HSV-1 infektion. Vi föreslår att denna metod kan antas som en generell metod att studera det nukleära vs. cytoplasmiska translokationen för andra virus eller cellulära proteiner, som kan fungera som ett alternativ till levande imaging när den levande bildteknik är tillämplig på grund problem såsom märkning metoden, signalintensitet eller protein överflöd.
Detta protokoll har använts för att studera på kärn-till-Cytoplasmatisk flyttning av HSV-1 ICP0. ICP0 genomgår subcellulär människohandel under HSV-1 infektion (figur 1). Troligt, ICP0 interagerar med olika cell vägar att utföra olika uppgifter på olika platser. Detta gör ICP0 att finjustera sina flera funktioner i dragkampen med mänsklig värd13. Men studerats hur ICP0 samordnar flera funktioner i en spatial-temporal sätt väl. Med fluorescerande mikrosk…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar finansiellt stöd från en NIH grant (RO1AI118992) tilldelas Haidong Gu. Vi tackar mikroskopi, bildbehandling och flödescytometri resurser (MICR) Core anläggningen vid Wayne State University för teknisk support.
Cells and viruses | |||
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
Medium | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
Reagents | |||
4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
Horse Serum | Sigma | H1270 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
Nail Polish | Sally Hansen | ||
Equipment | |||
Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
Excel software | Microsoft Excel | ||
HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |