שיטת פעילות אנדוטוקסין לאיתור דם כולו אנדוטוקמיה בחולים חולי אנוש

Summary

בזאת אנו מציגים פרוטוקול למדוד במיטה את פעילות האנדוטוקסין של דגימות הדם האנושיות. הבדיקה של פעילות אנדוטוקסין היא מבחן פשוט לבצע והוא עשוי להיות ביוארקר שימושי בחולים באורח אנוש חולה עם אלח דם.

Abstract

ליפופוליסכריד, הידוע גם בשם אנדוטוקסין, הוא מרכיב בסיסי של חיידקים גראם שליליים וממלא תפקיד מכריע בפיתוח אלח דם והתחשמלות. הזיהוי המוקדם של תהליך מידבק המתפתח במהירות למחלה קריטית עשוי לבקש טיפול מהיר ואינטנסיבי יותר, ובכך עלול להוביל לתוצאות מטופלים טובים יותר. פעילות אנדוטוקסין (EA) ניתן להשתמש במיטה כסמן אמין של אנדוטוקסין מערכתית. הזיהוי של רמות פעילות אנדוטוקסין מוגבר הוכח שוב ושוב להיות משויך חומרת מחלה מוגברת אצל חולים עם אלח דם והתחשמלות. התהליך מהיר וקל לביצוע. בקצרה, לאחר הדגימה, מעורב של דם שלם מעורבב עם נוגדן אנטי אנדוטוקסין ועם LPS הוסיף. הפעילות האנדוטוקסין נמדדת כפרץ חמצוני יחסי של בינויטרופילים כפי שזוהה על ידי chemioluminescence. תפוקת הספק מתבטאת בקנה מידה מ -0 (נעדר) ל-1 (מקסימלי) ומסווגים כ-“נמוך” (< 0.4 יחידות), "ביניים" (0.4 – 0.59 יחידות), או "גבוהה" (≥ 0.6 יחידות). המתודולוגיה והרציונל המפורטים למימוש שיטת EA מדווחים בכתב יד זה.

Introduction

ליפופוליסכריד (LPS), הידוע גם בשם אנדוטוקסין, הוא רכיב מפתח של מבנה הממברנה של חיידקים גראם שליליים (GN). זה מפצה על 10% של קיר התא, להיות חיוני עבור שלמות הקרום החיצוני הומאוסטזיס. יתר על כן, הוא activator חזק של המארח מולדת המערכת החיסונית^1,2.

בחשיפה מחוץ לגופית של תאי מערכת החיסונית מולדים ל-LPS מוביל שינויים בביטוי של גנים מרובים³. המינהל של כמויות קטנות מאוד של lps במתנדבים אנושיים בריאים מפעיל את המפל של דלקת מערכתית חריפה, בעוד אלח דם והתחשמלות עלול להתעורר עם ריכוזי אנדוטוקסין גבוהה יותר^4,5.

אלח דם הוא מצב מסכן חיים אשר, אם לא מזוהה מיד, יכול להוביל לכישלון רב איברים ומוות. חולים ספיגה חייב להיות מטופלים בזמן, עם החייאה אגרסיבי, טיפול אנטיביוטי נאותה, בקרת מקור אופטימלית, ואסטרטגיות הנחיה תמיכה איברים. האבחנה של האטיולוגיה של אלח דם מבוססת בעיקר על זיהוי קליני וזיהוי הפתוגן מבוסס התרבות⁶. עם זאת, תוצאות של תרבויות מיקרוביאלית יכול לקחת עד 48 h ולא חד-משמעית של עד 30% מהמקרים⁷. הזדהות מוקדמת והתערבות עלולה להוביל לתוצאות מטופלים טובות יותר. בחולים בהם מחשוד אלח דם, החלטות מתקבלות לעתים קרובות על בסיס פרמטרים פיזיולוגיים וביוכימיים, ללא סימן ברור לאנדוטוקסין.

המדידה של פעילות אנדוטוקסין (EA) ניתן להשיג באמצעות שיטת מסחרית (ראה טבלת חומרים) בדם שלם. זה יכול לשמש בסמנים של אנדוספמיה מערכתית עבור ריבוד מוקדם של חומרת המחלה, במיוחד בחולים בסיכון לפיתוח הלם ספיגה⁸. הטיפול שימש כדי להנחות Polymyxin B הרבה תרפיה לאחרונה שפורסמה פעמיים סמיות מבוקר אקראי ניסוי קליני בחולים עם הלם ספיגה⁹. בחולים חולי נפש, המחקר מדיק הראה מוגברת רמות EA להיות משויך לתפקוד איברים מרובים, יחידת טיפול נמרץ (טיפול נמרץ) אורך של שהייה, ואת התמותה¹⁰.

שונה מאוד. שיטת Limulus אמבות ליפוסט (לל א), כמו ג’ל-קריש, turbidimetric, או מבחן כרומוגניים, כבר הרבה יותר מאומץ לעתים קרובות להערכת הנסיוב האנדוטוקסין. הוא מבוסס על היכולת של אנדוטוקסין כדי לגרום קרישה של המוליש של סרטן הפרסה, לימוליוס פוליפהימוס. עם זאת, לבחינה זו יש מגבלות מסוימות במונחים של ספציפיות. בפרט, זה יכול להיות גם מופעל על ידי מוצרים מחיידקים אחרים מאשר אנדוטוקסין, כגון רכיבים של הקיר תא פטרייתי, וזה יכול להיות מעוכב על ידי חלבונים שונים פלזמה האדם¹¹.

בעשור האחרון המדידה של EA פותחה ואומתה בתור ביואריקר של במחזור אנדוטוקסין. לעומת מבחן לל א, EA הוא מהיר וקל יותר ליישם בסביבה הקלינית. יתר על כן, זה הוכח להיות מדויק יותר מאשר בדם שלם, עם רגישות מוגברת וספציפיות, הן מבחנה ב vivo¹².

למרות היישום הראשוני שלה ככלי אבחון מוקדם לזיהוי מהיר של חיידקים GN כמו סוכנים סיבתי אלח דם, רמת EA גם נחקרו בתור ביוארקר של חומרת המחלה. בהקשר זה, זה הוכח להיות שימושי במיוחד כדי להעריך את מצב זילוח בשל מחלה קריטית שוטפת, כגון הלם ספיגה או תסמונת לאחר הלב מעצר¹³. לאחרונה, מאז התפתחות מערכות המופיליה, תוצאת EA חיובית הוצע גם ככלי סינון כדי לזהות במדויק מועמדים פוטנציאליים עבור טיפול כזה¹⁴. ערכנו לאחרונה מחקר התצפית רטרוספקטיבי על שכיחות ומשמעות קלינית של רמות גבוהות מוקדם של EA ב 107 חולים עם הלם ספיגה. בשורה עם תוצאות אחרונות אחרות, גילינו כי EA הוא סמן מבטיח של חומרת המחלה בחולים עם הלם ספיגה¹⁵.

מטרת כתב היד הנוכחי היא לתאר את השיטה לביצוע שיטת EA, במיטה או במעבדה, ולתאר את השימוש הפוטנציאלי שלה בתרחיש מייצג של הלם זיהומי. טכניקה זו יכולה לזהות את הפעילות LPS על ידי מדידת פרץ חמצוני משופר ב נויטרופילים בעקבות הטרמה שלהם על ידי מכלולי אנטי-אנדוטוקסין נוגדן ו-LPS. פרץ הנשימה המוגבר מזוהה על ידי כימומטר וכמות האור הנפלט נחשבת פרופורציונלית לכמות האנדוטוקסין בדגימת הדם. הצורך מחייב כמה ריאגנטים, לוקח בערך 30 דקות לבצע ומשתמש מעט כמו 40 μL של דם שלם¹².

Protocol

הפרוטוקול מתנהל בהתאם להנחיות המוסדיות הנוגעות לטיפול בדגימות אנושיות ולאחר הליכי הניתוח הסטנדרטיים הנוכחיים של המעבדה הקלינית שלנו. השימוש בנתוני EA ומידע קליני של חולים נבדק עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסד שלנו. 1. ציוד מעבדה וערכת שיטת הערכה <l…

Representative Results

גבר בן 72 הוסמך למחלקה לשעת חירום (ED) של בית חולים עירוני אקדמי. כמה ימים קודם לכן הוא הציג לרופא המטפל העיקרי שלו מתלונן על שריפת שתן. טיפול קצר במסלול עם פוספומצין אוראלי היה מומלץ. ההיסטוריה הרפואית שלו כללה יתר לחץ דם, סוכרת סוג 2 מסובכת היפרפלזיה שפיר של הערמונית. התרופו?…

Discussion

הלם ספיגה עדיין משויך כיום לתמותה גבוה כמו 40%, למרות שיעור זה משתנה בהתאם לדוחות נחשב¹⁶. הצורך הרומן ובסמנים טוב יותר הוא דגלו על ידי רוב המומחים בתחומים כדי לסייע מטפלים באבחון מוקדם, ניהול טוב יותר, והתחזיות של חולים עם הלם ספיגה⁶.

ביצוע מבחן EA אינו ?…

Materials

EAA kit	Spectral Medical Inc.	EAAST-20	Package with 20 tests + 1 quality control
Smart Line TL	Berthold	EAASL	Luminometer
Incubator shaker	GRANT	ES-20	Mini-incubator shaker
Vortexer	VWR	444-2790	Vortex instrument