Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro
Summary
Nous présentons ici un protocole intégré qui mesure la sous-population de monocyte traite sous flux in vitro par l’utilisation de marqueurs de surface spécifiques et la microscopie confocal fluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour explorer les étapes séquentielles de recrutement aussi bien quant à profil autres sous-types de leucocytes à l’aide d’autres marqueurs de surface spécifiques.
Abstract
Le recrutement des monocytes du sang vers les tissus périphériques ciblés est essentiels pour le processus inflammatoire au cours de la lésion tissulaire, le développement de tumeurs et les maladies auto-immunes. Ceci est facilité grâce à un processus de capture de libre circulation sur la surface luminale de cellules endothéliales activées, suivie de leur migration transendothéliale et de l’adhérence (transmigration) dans le tissu sous-jacent affecté. Cependant, les mécanismes qui prennent en charge le recrutement préférentiel et contextuelle des sous-populations de monocytes ne sont pas encore pleinement compris. Par conséquent, nous avons développé une méthode qui permet le recrutement des sous-populations de monocyte différents en même temps visualisé et calculées sous flux. Cette méthode basée sur l’imagerie confocale Time-lapse, permettant de distinguer sans ambiguïté les monocytes adhérentes et réincarnés. Ici, nous décrivons comment cette méthode peut être utilisée pour étudier simultanément la cascade de recrutement des monocytes pro-angiogénique et non-angiogéniques in vitro. En outre, cette méthode peut être étendue afin d’étudier les différentes étapes du recrutement de trois populations de monocytes.
Introduction
Monocytes constituent une composante phagocytaire de l’immunité innée qui est essentielle pour la lutte contre les agents pathogènes, nettoyer les tissus endommagés, l’angiogenèse et la pathophysiologie de nombreuses maladies dont les cancers1,2,3 . Les monocytes sont des cellules dérivées de la moelle osseuse composées de populations hétérogènes qui circulent dans le sang, mais peuvent être recrutées sur le site de l’inflammation dans les tissus périphériques par le biais de mécanismes moléculaires spécifiques. Les cascades de recrutement des monocytes, en ce qui concerne les leucocytes en général, implique différentes étapes, y compris la capture, rouler, ramper, arrestation, la migration transendothéliale (transmigration) et migration à travers la paroi des vaisseaux (membrane basale et peinture murale 4de cellules). Ces mesures concernent principalement induite par l’inflammation des molécules sur la surface endothéliale luminale comme sélectines, ligands glycoprotéine, chimiokines, molécules d’adhésion intercellulaire et jonctionnel et leurs récepteurs sur leucocytes comme sélectine ligands et les intégrines. Voies de trafic à travers les jonctions de cellules endothéliales (paracellulaires) ou par l’intermédiaire de l’organisme de cellules endothélial (transcellulaire) peuvent être utilisés par les leucocytes de franchir la barrière endothéliale5. Tandis que les monocytes ont historiquement été documentés à transmigrer la voie transcellulaire, divergences potentielles dans leur voie migratoire ont été proposés comme monocytes ne sont plus considérés comme une population homogène de cellules. Il est maintenant évident que la diversité des monocytes peuvent être définies par chacun de leurs différences et points communs, en ce qui concerne leur extravasation distinctive cascades3,6. Par conséquent, afin de distinguer sans ambiguïté les sous-populations de monocytes, il est crucial de visualiser, et le processus de phénotype le comportement de chacun de ces différentes sous-populations lors du recrutement.
Monocytes d’être humain, porc, rat et souris ont été subdivisées en sous-populations phénotypiques avec certaines fonctions attribuées et les comportements migratoires spécifiques7,8,9. Par exemple, chez les humains, monocytes se divisent en trois sous-ensembles basés sur leur expression superficielle de CD14, un corécepteur pour lipopolysaccharide bactérien et CD16, les récepteurs Fc-gamma III. Sous-populations de monocyte humain incluent CD14 classique+CD16–, les intermédiaires CD14+CD16+ et non-classique CD14dimCD16+ cellules6,9. Le CD14 classique+CD16– monocytes se sont avérées être principalement inflammatoire alors que la piscine du CD16+ monocytes trouvées collectivement de présenter TIE2 expression et on fonction10. Régulièrement, la stimulation des cellules endothéliales par des cytokines inflammatoires telles que la nécrose de tumeur humaine facteur α (TNF) ou l’interleukine (il-1) beta (inflammation conventionnelle) est suffisante pour déclencher le recrutement complet de CD14 classique+CD16 – monocytes. Cependant, des actions simultanées de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) A et de TNFα (inflammation d’axée sur les facteurs angiogéniques) sont nécessaires pour provoquer la transmigration de le CD16+ on piscine de monocytes3. Historiquement, le système traditionnel de Transwell sous des conditions statiques, la chambre de flux de plaques parallèles et les chambres de débit µ-diapositive ont été utilisées pour analyser quantitativement le recrutement de la population à un moment en vitro11 un leucocyte ,12,13. Tandis que ces protocoles ont été validés, une méthode plus robuste permettant l’analyse simultanée de plusieurs sous-populations de monocyte serait considérée comme plus perspicace. Ces méthodes doivent tenir compte des interactions multiples et les différentes fréquences de chaque population respective et également fournir une interprétation mécaniste des similarités et des spécificités pour les cascades de recrutement qui définissent chaque monocyte sous-ensemble.
Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie Time-lapse de recrutement de monocytes sous flux qui permet les cascades migrateurs des sous-populations de monocyte différents à étudier simultanément à l’aide de la microscopie confocale. Cette méthode intègre certaines caractéristiques essentielles qui imitent l’inflammation des cellules endothéliales, ainsi que l’hémodynamique des monocytes dans les veinules post capillaires, en circulation l’emplacement principal du recrutement des leucocytes in vivo. La méthode proposée utilise des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), qui sont générés par un protocole bien établi d’isolement du humaine de cordons ombilicaux. Cette ressource clinique a l’avantage d’être facilement disponible comme sous-produit biologique, tout en fournissant également un rendement raisonnable des cellules endothéliales qui peuvent être isolés dans la veine ombilicale. Nous avons également utilisé les colorants fluorescents et immunofluorescence d’établir une distinction entre les différents composants cellulaires et microscopie confocale de définir sans ambiguïté le monocyte positionnement (luminal vs abluminal) au fil du temps. Le protocole présenté ici a été développé pour mesurer simultanément les niveaux de la transmigration des sous-populations de monocytes. En outre, il convient de noter que cette méthode peut être étendue afin d’étudier les autres sous-populations de leucocytes et le processus de recrutement par l’utilisation de différents biomarqueurs et l’étiquetage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous rapportons ici une méthode décrivant une étude de comment les sous-populations de monocyte transmigrer par le biais de la monocouche endothéliale enflammée. La méthode discutée utilisé la microscopie confocale au lieu de la microscopie à contraste de phase, qui est également utilisée pour étudier le recrutement des monocytes sous flux3,11,19. Un des principaux avantages de l’utilisation de la microscopie confo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Paul Bradfield pour lecture de manuscrit et des rétroactions. A. S. a reçu un soutien financier de la Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust Reg.,
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
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