Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro
Summary
Aquí, presentamos un protocolo integrado que mide la subpoblación de monocito tráfico bajo flujo in vitro por el uso de marcadores de superficie específicos y microscopía de fluorescencia confocal. Este protocolo puede utilizarse para explorar medidas de reclutamiento secuencial así como a otros subtipos de leucocitos usando otros marcadores de superficie específicos del perfil.
Abstract
El reclutamiento de monocitos de la sangre a los tejidos periféricos específicos es fundamental para el proceso inflamatorio durante la lesión tisular, desarrollo de tumores y enfermedades autoinmunes. Esto se facilita a través de un proceso de captura de flujo libre en la superficie luminal de las células endoteliales activadas, seguido por su migración de adherencia y transendothelial (transmigración) a los tejidos subyacentes afectados. Sin embargo, no se entienden los mecanismos que soportan la contratación preferencial y contextual de las subpoblaciones de monocitos. Por lo tanto, hemos desarrollado un método que permite la contratación de las subpoblaciones de monocitos diferentes para visualizar y medir bajo flujo simultáneamente. Este método, basado en la proyección de imagen confocal Time-lapse, permite la distinción inequívoca entre adherentes y transmigrated monocitos. Aquí, describimos cómo se puede utilizar este método para estudiar simultáneamente la cascada de reclutamiento de monocitos pro-angiogénica y no angiogénico in vitro. Además, este método se puede ampliar para estudiar las distintas etapas de la contratación de un máximo de tres poblaciones de monocitos.
Introduction
Monocitos constituyen un componente fagocitario de la inmunidad innata que es esencial para la lucha contra patógenos, limpieza de los tejidos dañados, angiogénesis y la fisiopatología de muchas enfermedades incluyendo cáncer1,2,3 . Los monocitos son células derivadas de médula ósea, compuestas de subpoblaciones heterogéneas que circulan en la sangre pueden ser reclutadas en el sitio de la inflamación en tejido periférico a través de mecanismos moleculares específicos. Las cascadas de reclutamiento de monocitos, en cuanto a los leucocitos en general, implica diversos pasos incluyendo captura, rodar, gatear, detención, migración transendothelial (transmigración) y migración a través de la pared del vaso (la membrana del sótano y mural células)4. Estos pasos consisten principalmente en inflamación inducida por moléculas en la superficie luminal endotelial selectinas ligandos de glicoproteína, quimiocinas, moléculas de adhesión intercelular y junctional, y sus receptores en los leucocitos como ligandos de selectina y las integrinas. Vías de tráfico a través de las uniones celulares endoteliales (paracelular) o a través del cuerpo de la célula endotelial (transcelular) pueden utilizarse por los leucocitos para atravesar la barrera endotelial5. Mientras que los monocitos se han documentado históricamente a transmigrada a través de la ruta transcelular, se han propuesto posibles divergencias en su camino migratorio como monocitos ya no se consideran una población celular homogénea. Ahora resulta claro que la diversidad de monocitos puede ser definido por cada una de sus diferencias y similitudes, con respecto a su extravasación distintivo cascadas3,6. Por lo tanto, para discriminar claramente entre subpoblaciones de monocitos, es fundamental visualizar y fenotipo el comportamiento de cada una de estas subpoblaciones diferentes durante la contratación del proceso.
Monocitos de humano, cerdo, rata y ratón se subdivide en subpoblaciones fenotípicas con ciertas funciones adscrito y comportamientos migratorios específicos7,8,9. Por ejemplo, en los seres humanos, los monocitos pueden dividirse en tres subconjuntos basados en su superficial expresión de CD14, un correceptor para lipopolisacárido bacteriano y CD16, receptor Fc gamma III. Subpoblaciones de monocitos humanos incluyen CD14 clásico+CD16–, intermedio CD14+CD16+ y no clásica CD14dimCD16 células de+ 6,9. El CD14 clásico+CD16– monocitos fueron demostrados para ser principalmente inflamatorias mientras que la piscina de CD16+ monocitos encontraron colectivamente presentar TIE2 expresión proangiogénico función10. Constantemente, la estimulación de células endoteliales con las citoquinas inflamatorias tales como necrosis del tumor humano factor α (TNF) o la interleucina (IL-1) beta (inflamación convencional) sea suficiente para la completa captación de CD14 clásico+CD16 – monocitos. Sin embargo, son necesarias para provocar la transmigración de la CD16 acciones simultáneas de A factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y TNFα (inflamación impulsado por factores angiogénicos)+ piscina proangiogénico de monocitos3. Históricamente, el sistema tradicional de Transwell bajo condiciones estáticas, la cámara de flujo paralelo de la placa y las cámaras de flujo μ diapositiva se han utilizado para analizar cuantitativamente el reclutamiento de la población de un leucocito en un tiempo en vitro11 ,12,13. Mientras que estos protocolos se han validado, un método más robusto que permite el análisis simultáneo de varias subpoblaciones de monocitos se consideraría más perspicaz. Esas metodologías deben cuenta para múltiples interacciones y las diferentes frecuencias de cada población respectiva y también proporcionar una comprensión mecanicista de las similitudes y especificidades para las cascadas de reclutamiento que definen cada monocito subconjunto.
Aquí, presentamos un método basado en la proyección de imagen de Time-lapse de reclutamiento de monocitos bajo flujo que permite las cascadas migratorias de subpoblaciones de monocitos diferentes a estudiar simultáneamente mediante el uso de microscopia confocal. Este método integra ciertas características que imitan la inflamación endotelial de la célula, así como la hemodinámica de la circulación de monocitos en vénulas post-capilares, la principal situación de reclutamiento leucocitario en vivo. El método propuesto utiliza células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que se generan a través de un protocolo bien establecido de aislamiento de cordón umbilical humano. Este recurso clínico tiene la ventaja de ser fácilmente disponibles como subproductos biológicos, mientras que también proporciona un rendimiento razonable de las células endoteliales que pueden ser aisladas de la vena umbilical. También utilizamos tintes fluorescentes y la inmunofluorescencia para distinguir entre los diferentes componentes celulares y la microscopia confocal para definir inequívocamente monocito posicionamiento (luminal y abluminal) con el tiempo. El protocolo que presentamos ha sido desarrollado para medir simultáneamente los niveles de la transmigración de las subpoblaciones de monocitos. Por otra parte, cabe señalar que esta metodología puede ampliarse para estudiar otras subpoblaciones de leucocitos y procesos de selección por medio de diferentes biomarcadores y etiquetado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, Divulgamos un método que detalla un estudio de cómo transmigrada subpoblaciones de monocitos a través de la monocapa de endotelio inflamada. Utiliza el método discutido microscopia confocal en vez de microscopia de contraste de fase, que también se utiliza para el estudio de reclutamiento de monocitos bajo flujo3,11,19. Una ventaja importante del uso de la microscopia confocal para Time-lapse de imágenes es la capac…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Dr. Paul Bradfield manuscrito lectura y retroalimentación. A. S. recibió apoyo financiero de la Sir Jules espina beneficencia ultramar Trust reg.,
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
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