نموذج الجنين الزرد بالتصور فيفو و المرتبطة "تحليل إينترافيتال لمادة بيولوجية" المكوّرات العنقودية الذهبية العدوى
Summary
تصف هذه الدراسة نموذجا جنين الزرد المجراة في التصور والتحليل إينترافيتال للعدوى المرتبطة بمادة بيولوجية على مر الزمن استناداً إلى الفحص المجهري الأسفار. هذا النموذج نظام واعدة لاستكمال نماذج الحيوانات الثديية مثل الماوس نماذج لدراسة الأمراض المرتبطة بمادة بيولوجية المجراة.
Abstract
العدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي) أحد أسباب رئيسية لفشل الأجهزة الطبية الحيوية. المكوّرات العنقودية الذهبية إحدى المسببات الرئيسية في بأي. النماذج الحالية تجريبية بأي الحيوانات الثديية مثل نماذج الماوس مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وذلك غير مناسبة لتحليل الإنتاجية العالية. وهكذا، الرواية نماذج حيوانية كنظم متكاملة للتحقيق بأي المجراة في المرغوب فيها. في هذه الدراسة، نحن تهدف إلى تطوير نموذج جنين الزرد المجراة في التصور والتحليل إينترافيتال للعدوى البكتيرية حضور الحيوية استناداً إلى الفحص المجهري الأسفار. وبالإضافة إلى ذلك، تدرس استجابة بلعم استفزاز. وتحقيقا لهذه الغاية، استخدمنا الفلورسنت معربا عن البروتين المذهبة س. والأجنة المعدلة وراثيا الزرد معربا عن البروتينات الفلورية في الضامة بهم ووضع إجراء لحقن البكتيريا وحدها أو بالاشتراك مع الجزئي المجالات الخرز الصغير في العضلات أنسجة الأجنة. لرصد تطور العدوى البكتيرية في الأجنة الحية على مر الزمن، ونحن استنباط طريقة بسيطة ولكنها موثوقة التهديف مجهرية للبكتيريا الفلورسنت. وأظهرت النتائج من التهديف مجهرية أن جميع الأجنة مع الوحدات المكونة للمستعمرة أكثر من 20 (زيمبابوي) من البكتيريا أسفرت عن إشارة إيجابية فلورسنت من البكتيريا. لدراسة الآثار المحتملة للمواد الحيوية على العدوى، حددنا الأرقام زيمبابوي في المذهبة س. مع أو بدون 10 ميكرون البوليستيرين الجزئي المجالات الخرز الصغير (PS10) كنموذج الحيوية في الأجنة. وعلاوة على ذلك، قمنا باستخدام ملف المشروع أوبجيكتج “الزرد-إيمونوتيست” العاملة في إيماجيج لقياس كثافة الأسفار من عدوى المكوّرات س. مع أو بدون ملاحظة:10 مع مرور الوقت. وأظهرت النتائج من كلا الأسلوبين أعلى الأرقام في المذهبة س. في الأجنة المصابة مع الجزئي المجالات الخرز الصغير مما في الأجنة دون الجزئي المجالات الخرز الصغير، مما يدل قابلية إصابة بزيادة حضور مادة بيولوجية. وهكذا، يظهر هذه الدراسة إمكانيات النموذجي الجنين الزرد للدراسة بأي مع الأساليب المتقدمة هنا.
Introduction
يتزايد استخدام مجموعة متنوعة من الأجهزة الطبية (يشار إليها على أنها “الحيوية”) في الطب الحديث لاستعادة أو استبدال أجزاء جسم الإنسان1. ومع ذلك، عند غرس الحيوية مريض للعدوى، دعا عدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي)، ومضاعفات رئيسية ليزرع في الجراحة. المكوّرات العنقودية الذهبية و المكوّرات العنقودية ابيديرميديس هي الأنواع البكتيرية الأكثر انتشارا هما مسؤولة بأي2،،من34،،من56. مزروع النموذج الحيوية على سطح عرضه لتشكيل بيوفيلم الجرثومي. وعلاوة على ذلك، قد تكون مختل الاستجابة المناعية المحلية بالحيوية مزروع، مما تسبب في انخفاض فعالية إزالة البكتيريا. الموافقة الأولية على إصابة البكتيريا يقوم أساسا بتسلل العَدلات، التي بشدة انخفاض قدرة جراثيم حضور المدرج أو مزروع مادة بيولوجية7. وعلاوة على ذلك، الضامة التسلل إلى الأنسجة بعد تدفق العَدلات الأولى سوف phagocytose البكتيريا المتبقية ولكن لا يمكن فعلياً قتلهم إينتراسيلولارلي، بسبب المناعة مختل مما يشير إلى أنه نتيجة لوجود مجتمعة مادة بيولوجية والبكتيريا8. وهكذا، يمكن تيسير وجود الحيوية البقاء داخل الخلايا للبكتيريا9،10،11،،من1213 وبيوفيلم تشكيل على مزروع الحيوية4،14. ونتيجة لذلك، قد تؤدي إلى الفشل بأي والحاجة إلى استبدال مزروع الحيوية، مما تسبب في زيادة معدلات الاعتلال والوفيات والاستشفاء المطول مع التكاليف الإضافية2،15.
ويجري عدد متزايد من استراتيجيات مكافحة–بأي المتقدمة2،،من1617. المجراة في تقييم فعالية هذه الاستراتيجيات في نماذج حيوانية ذات الصلة أمر ضروري. ومع ذلك، التقليدية التجريبية بأي نماذج حيوانية (مثل، الماوس نماذج) عادة ما تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لذلك غير مناسب لاختبار الإنتاجية العالية من استراتيجيات متعددة18. التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير الضوئية الحيوية استناداً إلى طرحه/فلوري تسمية الخلايا المضيفة والبكتيريا قد يسمح للرصد المستمر للتفاعلات بأي تطور والمضيف الممرض/المضيف-المواد في الحيوانات الصغيرة واحدة مثل الفئران18،19،،من2021. ومع ذلك، هذا الأسلوب معقد نسبيا ولا تزال في مهدها، ويجب معالجة عدة قضايا للتحليل الكمي بأي18. على سبيل المثال، مطلوب بجرعة عالية من تحدي لتصور الاستعمار الجرثومي. وبالإضافة إلى ذلك، على ضوء التشتت والامتزاز إشارات الإضاءة الحيوية/الأسفار في أنسجة الثدييات اختبار الحيوانات كما يجب تناول18،،من1921. ولذلك، هي نماذج حيوانية مبتكرة، وفعالة من حيث التكلفة مما يسمح للتصور إينترافيتال والتحليل الكمي على مر الزمن قيمة النظم التكميلية للدراسة المجراة في بأي.
وقد استخدمت الزرد (الأجنة) كأداة في الحية تنوعاً لتشريح التفاعلات المضيف-مسببات المرض والإصابة المرضية للعديد من الأنواع البكتيرية مثل المتفطرة22،23من الزائفة الزّنجاريّة، الإشريكيّة القولونية26،24و العنقوديات البرازية faecalis2527. وقد أجنة الزرد العديد من المزايا مثل الشفافية الضوئية، وتكلفة الصيانة منخفضة نسبيا، وحيازة نظام المناعة عالية مماثلة لتلك في الثدييات28،29. وهذا يجعل الأجنة الزرد كائن نموذج الغاية الاقتصادية والمعيشية للتصور إينترافيتال وتحليل تطور العدوى والمضيف المقترنة الردود28،29. للسماح لتصور سلوك الخلية خطوط الزرد في الحية، ومحوره وراثيا مع أنواع مختلفة من الخلايا المناعية (مثل الضامة، والعدلات) وحتى مع المعلمة فلوريسسينتلي الهياكل سوبسيلولار وقد وضعت28 ،29. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر معدل الإنجاب عالية الزرد إمكانية تطوير نظم اختبار إنتاجية عالية يتميز الحقن الآلية المؤتمتة والأسفار الآلي الكمي و تحليل الحمض النووي الريبي تسلسل27، 30.
في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى وضع نموذج الزرد جنين للعدوى المرتبطة بمادة بيولوجية باستخدام تقنيات التصوير الأسفار. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير إجراء لحقن البكتيريا (S. aureus) حضور مادة بيولوجية الجزئي المجالات الخرز الصغير الأنسجة العضلية الزرد الأجنة. كنا المذهبة س. RN4220 وإذ تعرب عن مشري الفلورسنت البروتين (S. aureus-مشري)، الذي شيد كما هو موضح في مكان آخر لآخر10،سلالة المذهبة س. 31. السطر الزرد المحورة وراثيا (mpeg1: UAS/كايد) معربا عن كايد واستخدمت بروتين فلوري أخضر في الضامة32 والأزرق الفلورسنت البوليستيرين الجزئي المجالات الخرز الصغير. في دراسة سابقة، وقد أظهرنا أن ضخ العضلي الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة الزرد لتقليد غرس مادة بيولوجية هي عمليا33. لتحليل كمي التقدم بأي وتسلل خلية مرتبطة في الأجنة واحد مع مرور الوقت، كنا ملف المشروع “الزرد-إيمونوتيست” الذي يجري تشغيله في “أوبجيكتج” (المكونات في إيماجيج) لقياس كثافة الأسفار البكتيريا المقيمين والضامة التسلل إلى محيط موقع الحقن الجزئي المجالات الخرز الصغير33. وباﻹضافة إلى ذلك، عقدنا العزم الأرقام لتشكيل مستعمرة وحدات (زيمبابوي) من البكتيريا في الوجود والغياب الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة لدراسة الآثار المحتملة للمواد الحيوية على العدوى. لدينا هذه الدراسة يتبين أن الجنين الزرد مع الأساليب المتقدمة هنا، نموذج حيوانات الفقارية واعدة، ورواية لدراسة الإصابات المرتبطة بمادة بيولوجية المجراة.
Protocol
Representative Results
Discussion
العدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي) مضاعفات سريرية خطيرة. فهم أفضل للآلية المرضية بأي المجراة في أن يوفر رؤى جديدة لتحسين الوقاية والعلاج بأي. بيد أن الحالية تجريبية بأي نماذج حيوانية مثل نماذج مورين هي مكلفة وتتطلب عمالة مكثفة، وتتطلب تدريب العاملين المتخصصين في التقنيات الجراحية المع?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة ماليا يدعمها المشروع إيبيزا البرنامج المواد الطبية الحيوية (بم) ويشترك في تمويله وزارة الشؤون الاقتصادية في هولندا. الكتاب يود أن يشكر الأستاذ الدكتور غراهام ليشكي من جامعة موناش، أستراليا لتوفير خط الزرد المحورة وراثيا (mpeg1:Gal4/UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
References
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis – the ‘accidental’ pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts – Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W., Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. , 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -. V., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. . Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
