Vivo दृश्य और Intravital विश्लेषण में के लिए एक Zebrafish भ्रूण मॉडल-संबंधित Staphylococcus aureus संक्रमण
Summary
वर्तमान अध्ययन vivo दृश्य में के लिए एक zebrafish भ्रूण मॉडल का वर्णन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के आधार पर समय के साथ-साथ संबंधित संक्रमण के intravital विश्लेषण. इस मॉडल में एक होनहार प्रणाली है जैसे कि vivo में भौतिक-संबद्ध संक्रमण का अध्ययन करने के लिए माउस मॉडल के रूप में स्तनधारी पशु मॉडल पूरित ।
Abstract
जैव-पदार्थ से जुड़े संक्रमण (बाई) की विफलता का एक प्रमुख कारण है बायोमेडिकल डिवाइस/ Staphylococcus aureus बाई में प्रमुख रोगजनकों में से एक है । वर्तमान प्रयोगात्मक बाई स्तनधारी माउस मॉडल जैसे पशु मॉडल महंगा और समय लेने वाली हैं, और इसलिए उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है । इस प्रकार vivo में बाई की जांच के लिए पूरक सिस्टम के रूप में उपन्यास पशु मॉडल वांछित हैं । वर्तमान अध्ययन में, हम vivo दृश्य में के लिए एक zebrafish भ्रूण मॉडल विकसित करने के उद्देश्य से और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के आधार पर आधारित intravital की उपस्थिति में बैक्टीरियल संक्रमण का विश्लेषण. इसके साथ ही इसमें रूठा मैक्रोफेज रिस्पॉन्स का अध्ययन किया गया । इस अंत करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त एस aureus और ट्रांसजेनिक zebrafish उनके मैक्रोफेज में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त भ्रूण और एक प्रक्रिया विकसित करने के लिए अकेले या एक साथ जीवाणुओं सुई में मांसपेशियों में microspheres के साथ इस्तेमाल किया भ्रूण के ऊतक । समय के साथ जीवित भ्रूण में जीवाणु संक्रमण की प्रगति की निगरानी करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की सूक्ष्म स्कोरिंग के एक सरल लेकिन विश्वसनीय विधि तैयार की । सूक्ष्म स्कोरिंग से परिणाम से पता चला है कि 20 से अधिक कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) बैक्टीरिया की एक सकारात्मक फ्लोरोसेंट संकेत उपज के साथ सभी भ्रूण । संक्रमण पर सामग्री के संभावित प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, हम aureus के साथ और बिना 10 µm polystyrene microspheres (PS10) के CFU संख्या भ्रूण में मॉडल के रूप में भौतिक विज्ञान का निर्धारण किया । इसके अलावा, हम ObjectJ परियोजना फ़ाइल “Zebrafish-Immunotest” ImageJ में ऑपरेटिंग के साथ और समय के साथ पुनश्च10 बिना एस प्रतिदीप्ति संक्रमण के aureus तीव्रता मात्रा का इस्तेमाल किया । दोनों तरीकों से परिणाम microspheres के बिना भ्रूण की तुलना में microspheres के साथ संक्रमित भ्रूण में aureus के उच्च संख्या में दिखाया गया है, एक वृद्धि हुई संक्रमण संवेदनशीलता का संकेत है की उपस्थिति में सामग्री । इस प्रकार, वर्तमान अध्ययन zebrafish भ्रूण मॉडल की क्षमता से पता चलता है कि यहां विकसित तरीकों के साथ बाई का अध्ययन ।
Introduction
चिकित्सा उपकरणों की एक किस्म (“के रूप में जैव” निर्दिष्ट) तेजी से आधुनिक चिकित्सा में इस्तेमाल कर रहे है बहाल करने के लिए या मानव शरीर के अंगों1की जगह । हालांकि, प्रत्यारोपण के आरोपण एक रोगी संक्रमण के लिए संवेदनशील है, कहा जाता है एक सामग्री से जुड़े संक्रमण (बाई), जो सर्जरी में प्रत्यारोपण की एक प्रमुख जटिलता है । Staphylococcus aureus और Staphylococcus epidermidis बाई2,3,4,5,6के लिए जिंमेदार दो सबसे प्रचलित जीवाणु प्रजातियों हैं । प्रत्यारोपित एक जीवाणु संरचना की सतह के गठन के लिए अतिसंवेदनशील सामग्री फार्म । इसके अलावा, स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रत्यारोपित सामग्री द्वारा विक्षिप्त हो सकता है, बैक्टीरियल निकासी के कम प्रभावशीलता के कारण । बैक्टीरिया को संक्रमित करने की प्रारंभिक मंजूरी न्यूट्रोफिल, जो दृढ़ता से एक डाला या प्रत्यारोपित जीवाणुनाशक की उपस्थिति में क्षमता कम हो गई है घुसपैठ द्वारा मुख्य रूप से किया जाता है7. इसके अलावा, मैक्रोफेज न्यूट्रोफिल की प्रारंभिक आमद के बाद ऊतक घुसपैठ शेष बैक्टीरिया phagocytose जाएगा, लेकिन प्रभावी ढंग से उन्हें intracellularly को मार नहीं सकता, विक्षिप्त प्रतिरक्षा संकेतन कि संयुक्त उपस्थिति का एक परिणाम है के कारण इस सामग्री और बैक्टीरिया8। इस प्रकार, की उपस्थिति intracellular बैक्टीरिया9,10,11,12,13 और प्रत्यारोपित पर फिल्म के गठन के अस्तित्व की सुविधा कर सकते हैं 4,14. नतीजतन, बाई विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते है और प्रत्यारोपित के प्रतिस्थापन के लिए की जरूरत है, वृद्धि की रुग्णता और मृत्यु के कारण और अतिरिक्त लागत के साथ लंबे समय तक अस्पताल में भर्ती2,15।
एंटी बाई रणनीतियों की बढ़ती संख्या2,16,17विकसित किया जा रहा है । संबंधित पशु मॉडलों में इन रणनीतियों की प्रभावकारिता के vivo मूल्यांकन में आवश्यक है । हालांकि, पारंपरिक प्रयोगात्मक बाई पशु मॉडल (जैसे, माउस मॉडल) आम तौर पर महंगा है, समय लेने वाली, और इसलिए कई रणनीतियों18के उच्च प्रवाह परीक्षण के लिए उपयुक्त नहीं है । bioluminescent/मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया की लगातार निगरानी के लिए अनुमति दे सकता है के आधार पर जैव ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीकों के हाल के विकास बाई प्रगति और मेजबान के सतत मॉनिटरिंग-रोगज़नक़/मेजबान एक छोटे जानवरों में सामग्री बातचीत जैसे चूहों18,19,20,21. हालांकि, इस तकनीक अपेक्षाकृत जटिल है और अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, और कई मुद्दों बाई18के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए संबोधित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, एक उच्च चैलेंज खुराक बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण कल्पना करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, प्रकाश कैटरिंग और स्तनधारी परीक्षण पशुओं के ऊतकों में bioluminescence/प्रतिदीप्ति संकेतों के सोखना भी18,19,21को संबोधित किया जाना चाहिए । इसलिए, उपंयास, लागत प्रभावी पशु intravital दृश्य और समय पर मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति मॉडल vivo में बाई का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान पूरक प्रणाली हैं ।
Zebrafish (भ्रूण) एक विच्छेदन के लिए vivo उपकरण में बहुमुखी के रूप में इस्तेमाल किया गया है-रोगज़नक़ बातचीत और संक्रमण रोगजनन के रूप में कई जीवाणु प्रजातियों के आइसोलेटों22, Pseudomonas aeruginosa23, ई कोलाई२४, Enterococcus faecalis२५, व staphylococci२६,२७. Zebrafish भ्रूण ऐसे ऑप्टिकल पारदर्शिता के रूप में कई फायदे हैं, एक अपेक्षाकृत कम रखरखाव लागत, और एक प्रतिरक्षा प्रणाली के कब्जे के अत्यधिक है कि स्तनधारियों में28,29के समान । यह zebrafish भ्रूण एक अत्यधिक आर्थिक, intravital दृश्य और संक्रमण प्रगति और संबद्ध मेजबान के विश्लेषण के लिए मॉडल जीव जीवित बनाता है28,29। vivo में सेल व्यवहार के दृश्य की अनुमति देने के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के साथ ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों (जैसे, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल) और यहां तक कि फ्लोरोसेंट टैग उपसेलुलर संरचनाओं के साथ28 विकसित किया गया है ,29. इसके अलावा, zebrafish की उच्च प्रजनन दर स्वचालित रोबोट इंजेक्शन की विशेषता उच्च प्रवाह परीक्षण प्रणालियों के विकास की संभावना प्रदान करता है, स्वचालित प्रतिदीप्ति ठहराव, और आरएनए अनुक्रम विश्लेषण27, 30.
वर्तमान अध्ययन में, हम प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर के लिए एक zebrafish भ्रूण जुड़े संक्रमण के लिए मॉडल का विकास करने का उद्देश्य । इस अंत करने के लिए, हम एक प्रक्रिया विकसित करने के लिए बैक्टीरिया (एस aureus) zebrafish भ्रूण की मांसपेशियों के ऊतकों में microspheres की उपस्थिति में इंजेक्शन । हम एस aureus RN4220 mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस aureus-mCherry), जो एक और एस aureus तनाव10,31के लिए कहीं और वर्णित के रूप में निर्माण किया गया था व्यक्त करते थे । ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन (mpeg1: यूएएस/Kaede) Kaede३२ और ब्लू फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज polystyrene में microspheres ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस इस्तेमाल किया गया । पिछले एक अध्ययन में, हमें पता चला है कि zebrafish भ्रूण में microspheres के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए सामग्री आरोपण नकल है व्यवहार्य३३। मात्रात्मक बाई की प्रगति और समय के साथ एक भ्रूण में जुड़े सेल घुसपैठ का विश्लेषण करने के लिए, हम “Zebrafish-Immunotest” परियोजना फ़ाइल जो “ObjectJ” के भीतर संचालित है (एक प्लग में ImageJ के लिए) का इस्तेमाल किया प्रतिदीप्ति तीव्रता यों तो बैक्टीरिया रहने और मैक्रोफेज microspheres३३के इंजेक्शन साइट के आसपास में घुसपैठ । इसके अलावा, हम कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) की उपस्थिति और भ्रूण में microspheres की अनुपस्थिति में बैक्टीरिया की संख्या का निर्धारण करने के लिए संक्रमण पर सामग्री के संभावित प्रभावों का अध्ययन । हमारे वर्तमान अध्ययन से यह दर्शाता है कि यहां विकसित तरीकों के साथ, zebrafish भ्रूण vivo में एक होनहार, उपंयास हड्डीवाला पशु मॉडल के अध्ययन के लिए है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
(बाई) संक्रमण से संबंधित एक गंभीर नैदानिक जटिलता है । vivo में बाई की रोगजनन की बेहतर समझ, बाई की रोकथाम और इलाज में सुधार के लिए नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी । हालांकि, murine मॉडल जैसे वर्तमान प्रयोगात्मक बाई ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के वित्तीय इबीसा परियोजना द्वारा जैव चिकित्सा सामग्री (बीएमएम) कार्यक्रम और सह आर्थिक मामलों के डच मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया । लेखक zebrafish ट्रांसजेनिक लाइन (mpeg1: Gal4/यूएएस: Kaede) प्रदान करने के लिए मोनाश विश्वविद्यालय, ऑस्ट्रेलिया से प्रो Dr. ग्राहम Lieschke शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
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