ゼブラフィッシュ胚モデルにおける生体内可視化と生体材料の生体解析黄色ブドウ球菌感染症
Summary
本研究では、生体内可視化と蛍光顕微鏡を基バイオマテリアル関連感染の生体内解析のためのゼブラフィッシュ胚モデルについて説明します。このモデルは、生体内での生体関連感染症を研究するためマウス モデルなど哺乳類の動物モデルを補完する有望なシステムです。
Abstract
生体材料関連感染 (BAI) は、バイオマテリアル ・医療デバイスの障害の主要な原因です。黄色ブドウ球菌は、白の主要な病原体のひとつです。現在実験 BAI 哺乳類動物モデル マウス モデルは、コストと時間がかかり、したがってハイスループット解析には適していないようです。したがって、体内の白を調査するための補完的なシステムとして新しい動物モデルが望まれます。本研究では、生体内可視化と蛍光顕微鏡による生体材料の存在下で細菌感染症の生体内解析のためのゼブラフィッシュ胚モデルの開発を目指しました。また、誘発マクロファージの応答を調べた。このため、我々 は蛍光蛋白質を表現する黄色ブドウ球菌や、マクロファージの蛍光蛋白質を表現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を使用して細菌単独で、または一緒に微粒子を筋肉に注入する手順を考案胚の組織。時間をかけてライブ胚における細菌感染症の進行を監視するため蛍光細菌の顕微鏡による得点のシンプルだが信頼性の高い方法を考案しました。顕微鏡得点から結果は細菌の以上 20 コロニー形成単位 (CFU) を持つすべての胚が細菌の肯定的な蛍光シグナルを得られました。感染に対する生体材料の潜在的な影響を研究するには、我々 は胚のモデル材料として 10 μ m のポリスチレン微小球 (10PS) と黄色ブドウ球菌の CFU の数字を決定しました。また、時間の経過とともに黄色ブドウ球菌感染症 PS10との蛍光強度を定量化するのに ObjectJ プロジェクト ファイル ImageJ で「ゼブラフィッシュ Immunotest」を使用。両方の方法からの結果は、微粒子、生体材料の存在下で増加感染感受性を示すことがなく胚よりも微粒子で感染した胚で黄色ブドウ球菌の高い数字を示した。したがって、本研究は、ここで開発された手法により研究して白にゼブラフィッシュ胚の可能性を示しています。
Introduction
ますますにさまざまな医療機器 (「生体材料」と呼ばれる) 現代医学で復元または人体パーツ1を置換するされます。ただし、生体材料の注入は患者を手術でインプラントの主要な合併症である生体関連感染 (白) と呼ばれる感染症素因となります。黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、2 最も一般的な細菌種の白2,3,4,5,6を担当。細菌のバイオ フィルム形成に影響を受けやすい表面生体フォームを注入しました。また、細菌クリアランスの減少効果を引き起こしている注入のバイオマテリアルによる局所免疫応答を錯乱させる可能性があります。細菌に感染した初期のクリアランスは、主に強く挿入されての存在下で殺菌能力の低下や生体材料7を注入した好中球の浸潤によって実行されます。さらに、マクロファージ組織を浸潤した好中球の初期流入残りの細菌を貪食、効果的にことはできません後それらを殺す細胞内、狂った免疫シグナリングの組み合わせの存在の結果であるため生体と細菌8。したがって、生体材料の存在が細菌9,10、11,12,13およびバイオ フィルム形成の植え付けられた細胞の生存を促進します。生体4,14。その結果、白が失敗につながるし、注入材料の交換を必要と追加コスト2,15に増加罹患率と死亡率と長期入院の原因します。
アンチ白戦略数の増加は、先進2,16,17をされています。適切な動物モデルにおけるこれらの戦略の有効性の in vivo 評価は不可欠です。しかし、伝統的な白モデル実験動物 (例えば、マウス モデル) は通常高価な時間のかかる、したがって複数の戦略18の高スループットのテストには適していません。宿主細胞や細菌の発光/蛍光ラベリングに基づく光ファイバー型バイオ イメージング技術の最近の進歩、BAI の進行およびホスト病原体/ホスト材料の相互作用単一小動物での連続モニタリングできるようにします。マウス18,19,20,21などしかし、この手法は、比較的複雑で、まだ始まったばかりで、白18の定量分析のためいくつかの問題を対処しなければなりません。例えば、細菌の植民地化を視覚化する挑戦の高線量が必要です。さらに、光散乱、動物もあります哺乳類のテストの組織における発光/蛍光信号の吸着対処18,19,21。したがって、時間をかけて生体内可視化と定量的な解析を可能にする、コスト効率の高い新しい動物モデル、BAI 体内を研究するための貴重な補完的なシステムであります。
ゼブラフィッシュ (胚) は、抗酸菌22、23緑膿菌、などいくつかの菌種の宿主-病原体相互作用と感染症を解剖するため生体内での多機能なツールとして使用されています。大腸菌ブドウ球菌腸球菌フェカリス252426,27。Zebrafish の胚には、光透過性、比較的低いメンテナンス コストと高い哺乳類28,29に類似する免疫システムの所有物など多くの利点があります。これは微小循環の可視化と感染症の進行と関連付けられたホスト応答28,29の分析のための高い経済、生活モデル生物 zebrafish の胚になります。(,マクロファージや好中球など) の免疫細胞の種類と生体内で、遺伝子導入ゼブラフィッシュ線細胞挙動の可視化を許可し、蛍光タグ細胞内構造をもされている28 を開発しました。、29。さらに、ゼブラフィッシュの高い繁殖率、自動ロボット注入、自動蛍光定量、RNA シーケンス解析27,高スループット テスト システムの開発の可能性30。
本研究では蛍光イメージング技術を用いた生体関連感染のゼブラフィッシュ胚の開発を目指しました。このため、生体微粒子の存在下でゼブラフィッシュ胚の筋組織に細菌 (黄色ブドウ球菌) を注入する手順を行った。黄色ブドウ球菌RN4220 表現する mCherry 蛍光タンパク質 (S の黄色ブドウ球菌– mCherry)、別黄色ブドウ球菌株10,31の他の場所で説明されているように建設されたを使用しました。トランスジェニックゼブラフィッシュ ライン (mpeg1: UA/楓) 楓、マクロファージ32青蛍光ポリスチレン微小球に緑色蛍光タンパク質を用いて表現します。以前の研究では、生体材料の注入を模倣するゼブラフィッシュ胚微粒子の筋肉内注射が可能な33を示しました。蛍光強度を数値化する「ObjectJ」(ImageJ のプラグイン) 内で運営されている「ゼブラフィッシュ Immunotest」プロジェクト ファイルを用いて BAI の進行と時間をかけて単一胚に関連する細胞浸潤を定量的に解析、存在する細菌や微粒子33の注射部位周辺に浸潤したマクロファージ。さらに、我々 はコロニー形成の数字を決定した単位 (CFU) 胚における微粒子の有無における細菌の潜在的な感染症に及ぼす生体材料を研究します。本研究は、ここで開発した方法、ゼブラフィッシュ胚は体内の生体材料関連感染症を研究するため、有望な新規脊椎動物のモデルを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
生体材料関連感染 (BAI) は、深刻な病態です。バイ国際体内の病態の理解は、予防と白の治療を改善するために新しい洞察力を提供します。ただし、現在白モデル実験動物マウス モデルなどはコストのかかる、労働集約的であり、複雑な手技の訓練を受けた専門スタッフが必要があります。したがって、これらのモデルは、高いスループット分析のため適していません。本研究がゼブラフィ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は財政的に生体材料 (BMM) プログラムのイビサ島プロジェクトによってサポートされ、共同オランダ経済省によって資金を供給します。著者はゼブラフィッシュの形質転換線を提供するためオーストラリア ・ モナシュ大学から教授グラハム Lieschke を感謝したい (mpeg1:Gal4/UAS:Kaede)。
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
References
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis – the ‘accidental’ pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts – Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W., Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. , 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -. V., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. . Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
