小鼠肾上腺的分离、固定和免疫荧光成像
Summary
本文提出了一种从小鼠中分离肾上腺的方法, 修复组织, 切片, 并进行免疫荧光染色。
Abstract
免疫荧光是一种公认的检测组织中抗原的技术, 使用 fluorochrome 共轭抗体, 具有广泛的应用范围。抗原的检测允许对多种细胞类型进行鉴定和鉴定。肾上腺位于肾脏上方, 由一层间充质细胞包裹, 是由两个不同组织组成的内分泌器官, 不同的胚胎起源, 肾中间胚层衍生的外皮质和神经冠的内部髓质。肾上腺皮质分泌类固醇 (即mineralocorticoids、糖皮质激素、性激素), 而肾上腺髓质则产生儿茶酚胺 (即肾上腺素、去甲肾上腺素)。在进行肾上腺研究时, 重要的是要能够区分独特的细胞与不同的功能。在这里, 我们提供了一个在我们的实验室开发的协议, 描述了一系列的顺序步骤, 以获得免疫荧光染色特征的细胞类型的肾上腺。我们首先关注的是小鼠肾上腺的解剖, periadrenal 脂肪的显微切除, 其次是组织的固定、处理和石蜡嵌入。然后我们用旋转切片描述组织块的切片。最后, 我们详细介绍了肾上腺免疫荧光染色的一个协议, 我们已经开发, 以尽量减少非特异性抗体结合和自发荧光, 以达到最佳的信号。
Introduction
免疫组化是一种检测组织成分的技术, 使用特定细胞分子的抗体和随后的染色技术检测共轭抗体1。这种免疫组化程序需要特定的固定和处理的组织, 通常是经验主义地确定的特定抗原, 组织和抗体使用2。固定是保持组织的 “原始” 状态的关键, 从而保持完整的细胞和亚胞结构和表达模式。需要进一步的处理和嵌入程序, 以准备组织切片成薄片, 用于组织学研究涉及免疫组化。
染色可以进行显色或荧光检测。显色检测要求利用酶将可溶性基质转化为不溶性的有色产品。虽然这种酶可以与识别抗原的抗体 (主要抗体) 结合, 但它更经常被共轭到识别主要抗体的抗体 (即二级抗体)。这种技术是高度敏感的;由酶反应产生的有色产物是 photostable 的, 只需要 brightfield 显微镜进行成像。然而, 显色染色可能不适合时, 试图想象两个共同本地化的蛋白质, 因为一个颜色的沉积可以掩盖另一个的沉积。在共同染色的情况下, 免疫荧光被证明是更有利的。免疫荧光的出现归因于阿尔伯特库恩斯和同事, 他们开发了一个系统来识别组织抗原与荧光素标记的抗体和可视化他们在切片组织紫外线光3。荧光检测是基于与荧光的抗体共轭的, 在激发后发出光。由于有几个显影在不同波长 (没有或小重叠) 排放, 这种检测方法是研究多种蛋白质的理想选择。
肾上腺是位于肾脏上方的一对配对器官, 其特点是两个 embryologically 不同的成分, 周围有一个间充质胶囊。外肾上腺皮质, 从肾中间胚层, 分泌类固醇激素, 而内部髓质, 来源于神经嵴, 产生儿茶酚胺, 包括肾上腺素, 去甲肾上腺素和多巴酚。肾上腺皮质组织学上和功能上划分三个同心区, 每个区域分泌不同类别的类固醇激素: 外透明球状 (zG) 产生 mineralocorticoids, 调节电解质稳态和血管内容积;中间透明束状带 (zF), 直接在 zG 下方, 分泌糖皮质激素, 通过动员能量储存来调节压力反应, 以增加血糖;和内透明网状 (锆), 合成性类固醇前体 (即,脱氢表雄酮 (DHEAS))4。
在不同种类之间存在肾上腺皮质分带的变化: 例如,毛里求斯缺乏锆。耐热细胞质5, 其独特的产后 X 区为小脂质较差细胞的胎儿皮层残余。X 区在雄性小鼠青春期消失, 在雌性小鼠第一次怀孕后, 或在未繁殖的雌性中逐渐退化6,7。此外, zG 的扭曲和厚度与 zG 附近的外周茎和祖细胞的组织有显著的差异。与其他啮齿动物不同的是, 这只老鼠在 zG 和 zF 之间有一个可见的未分化区 (祖), 它的作用是干细胞区和/或瞬变放大祖细胞区。无论是对大鼠, 还是仅仅是一个更突出的组织细胞群是未知的8,9。
肾上腺皮质的细胞含有脂质滴, 储存胆固醇酯, 作为所有类固醇激素10,11的前兆。 “类固醇激素分泌” 一词定义了从胆固醇生产类固醇激素的过程,通过一系列的酶反应, 涉及类固醇合成因子 1 (SF1) 的活动, 其表达是类固醇合成潜力的标志。在肾上腺, Sf1 表达仅存在于皮质细胞12。一项有趣的研究发现, 类固醇合成电位13的肾上腺皮质细胞内源生物素的表达。虽然这可能是基于生物素/链亲和素染色方法较高背景的原因, 由于检测到内源生物素的抗体共轭与链亲和素, 这一特点也可以用来区分类固醇合成肾上腺内其他人群的细胞,即内皮、囊膜和髓质细胞。
支配由交感神经节前神经元, 肾上腺髓质的特点是嗜碱性颗粒细胞与颗粒细胞质含有肾上腺素和去甲肾上腺素。髓质细胞被命名为 “嗜”, 是因为在氧化14后形成褐色色素的儿茶酚胺含量高。酪氨酸羟化酶 (TH) 是催化合成儿茶酚胺的速率限制步骤的酵素, 在肾上腺, 仅表达在髓质15。
在这里, 我们提出了一个小鼠肾上腺的隔离协议, 他们的植入石蜡切片和切片的处理, 并在肾上腺切片上进行免疫荧光染色的方法, 以确定构成的细胞类型肾上腺皮质和髓质。本协议是实验室中用于染色的标准, 用于我们的研究中经常使用的多种抗体。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议描述了一种分离小鼠肾上腺的方法以及切片石蜡嵌入小鼠肾上腺的制备和染色。
与我们测试的其他协议相比, 这种免疫荧光协议已被证明适合于我们实验室使用的大多数抗体。然而, 在某些情况下, 它可能需要一些调整, 以改善染色效果。一个可以很容易修改和测试的变量是固定长度。在我们的实验室中, 4% 只粉煤灰的孵化可以从1小时到4小时不等, 而在其他实验室中, 固?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢穆罕默德祖贝尔博士在制定本议定书方面提供的有益建议和技术援助。这项工作得到国家糖尿病和消化和肾脏疾病研究所的支持, 国立卫生研究院 2R01-DK062027 (动力局 H)。
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
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