Isolation, fiksering og immunfluorescens billeddannelse af musen binyrerne

Summary

Her vil vi præsentere en metode til at isolere binyrerne fra mus, lave væv, afsnit dem og udføre immunofluorescens farvning.

Abstract

Immunfluorescens er en veletableret teknik til påvisning af antigen i væv med beskæftigelse af fluorokrom-konjugerede antistoffer og har et bredt spektrum af programmer. Påvisning af antigener giver mulighed for karakterisering og identifikation af flere celletyper. Placeret over nyrerne og indkapslet af et lag af mesenchymale celler, er binyrerne en endokrine organ sammensat af to forskellige væv med forskellige embryologiske oprindelse, mesonephric mellemliggende mesoderm-afledte ydre cortex og de neurale Crest-afledte inderste medulla. Binyrebarken udskiller steroider (dvs., mineralkortikoider, glukokortikoider, kønshormoner), der henviser til, at adrenal medulla producerer katekolaminer (dvs., adrenalin, noradrenalin). Mens adrenal forsker, er det vigtigt at kunne skelne unikke celler med forskellige funktioner. Her giver vi en protokol udviklet i vores laboratorium, der beskriver en række sekventielle trin, der kræves for at opnå immunofluorescens farvning at karakterisere celletyper af binyrerne. Først fokuserer vi på dissektion af binyrerne mus mikroskopiske fjernelse af periadrenal fedt efterfulgt af fiksering, forarbejdning og paraffin indlejring af væv. Derefter beskriver vi, skæring af væv blokke med en Rotationsmikrotom. Endelig, vi detalje en protokol for immunfluorescent farvning af binyrerne, som vi har udviklet for at minimere både ikke-specifikke antistof bindende og autofluorescence for at opnå et optimalt signal.

Introduction

Immunhistokemi er en teknik til at påvise væv komponenter med brug af antistoffer specifikke cellulære molekyler og efterfølgende farvning teknikker til at opdage den konjugerede antistoffer¹. Denne immunhistokemiske procedure kræver specifikke fiksering og forarbejdning af væv, der bestemmes ofte empirisk for den specifikke antigen, væv og antistof udnyttet². Fiksering er afgørende for at bevare den “oprindelige” tilstand af vævet og dermed bevare intakt cellulære og subcellulært strukturer og udtryk mønstre. Yderligere er forarbejdning og indlejring procedurer forpligtet til at forberede væv til skæring i tynde skiver, der bruges til histologiske undersøgelser der involverer Immunhistokemi.

Immunfarvning kan udføres med enten kromogent eller fluorescerende detektion. Kromogent påvisning kræver udnyttelsen af et enzym til at konvertere et opløseligt substrat til en uopløselig farvet produkt. Mens dette enzym kan være konjugeret til antistof anerkende antigen (primære antistof), er det oftere konjugeret til antistof erkendelse af det primære antistof (dvs., de sekundær antistof). Denne teknik er meget følsomt; farvede produktet som følge af enzymatisk reaktion er photostable og kræver kun en brightfield mikroskop til billedbehandling. Dog kan kromogent immunfarvning ikke være egnet, når de forsøger at visualisere to proteiner, der co Lokaliser, da aflejring af én farve kan maskere deposition af den anden. For Co farvning, immunofluorescens har vist sig for at være mere fordelagtig. Fremkomsten af immunofluorescens tilskrives Albert Coons og kolleger, der har udviklet et system til at identificere væv antigener med antistoffer markeret med fluorescein og visualisere dem i sektioneret væv under ultraviolet lys³. Registrering af Fluorescens er baseret på et antistof konjugeret med et fluorophore, der udsender lys efter excitation. Fordi der er flere fluorophores med emissioner på forskellige bølgelængder (med ingen eller lille overlapning), er denne metode til påvisning ideelt for studier af flere proteiner.

Binyrerne er et parret organ placeret over nyrerne og karakteriseret ved to embryologically særskilte komponenter omgivet af en mesenchymale kapsel. Ydre binyrebarken, afledt af mesonephric mellemliggende mesoderm, udskiller steroidhormoner, mens den inderste medulla, afledt af neurale crest, producerer katekolaminer, herunder adrenalin, noradrenalin og dopamin. I binyrebarken er histologisk og funktionelt opdelt i tre koncentriske zoner, med hver zone secernerende forskellige klasser af steroid hormoner: ydre zona glomerulosa (zG) producerer mineralkortikoider, der regulerer elektrolytten homøostase og intravaskulær volumen; den midterste zona fasciculata (zF), udskiller direkte under zG, glukokortikoider, der mægle stressrespons gennem mobilisering af energi butikker at øge plasma glukose; og de indre zona reticularis (zR), som syntetiserer sex steroid prækursorer (dvs., dehydroepiandrosterone (DHEAS))⁴.

Nogle variation i binyrebarkhormon zonation er til stede mellem arter: for eksempel, Mus musculus mangler zR. Den unikke postnatal X-zone af M. musculus er en rest af føtal cortex karakteriseret ved små lipid-fattige celler med acidophilic cytoplasms⁵. X-zone forsvinder i puberteten i mandlige mus og efter den første graviditet i hunmus eller degenererer gradvist i ikke-opdrættet hunner^6,7. Desuden markeret tortuosity og tykkelse af zG udstiller variation mellem arter, som gør organisationen af perifere stamceller og stamfader celler i og støder op til zG. Rotte, i modsætning til andre gnavere, har en synlig udifferentierede zone (zU) mellem zG og zF der fungerer som en stamcelle zone og/eller en zone af forbigående forstærke stamfaderen. Om zU er unikke for rotter eller blot en mere prominently arrangeret klynge af celler er ukendt^8,9.

Celler af binyrebarken indeholder lipid dråber, der gemmer kolesterol estere, der tjener som en forløber for alle steroidhormoner^10,11.  Udtrykket “steroidogenesis” definerer processen med produktion af steroidhormoner fra kolesterol via en serie af enzymatiske reaktioner, der involverer aktiviteten af steroidogene faktor 1 (SF1), hvis udtrykket er en markør for steroidogene potentiale. I binyrerne findes Sf1 udtryk kun i cellerne i cortex¹². En interessant undersøgelse fundet udtryk af endogent biotin i binyrebarkhormon celler med steroidogene potentielle¹³. Mens dette kan være årsag til en højere baggrund i biotin/streptavidin-baserede farvnings-metoder, på grund af påvisning af endogent biotin af antistof konjugeret med streptavidin, kunne denne egenskab anvendes også til at skelne mellem den steroidogene celler fra andre befolkninger i binyrerne, dvs, endotel, kapsulær, og medulla celler.

Innerveres af sympatiske preganglionic neuroner, er binyremarven karakteriseret af baserig celler med en granuleret cytoplasma, der indeholder adrenalin og noradrenalin. Medulla celler er opkaldt “chromaffin” på grund af det høje indhold af katekolaminer, der danner en brun pigment efter oxidation¹⁴. Tyrosin hydroxylase (TH) er det enzym, der katalyserer den trafikhastighedsbegrænsning trin i syntesen af katekolaminer og i binyrerne, angives kun i medulla¹⁵.

Her præsenterer vi en protokol til isolering af musen binyrerne, deres forarbejdning til indlejring i paraffin og skæring, og en metode til at udføre immunofluorescens farvning på adrenal sektioner for at identificere de cellulære typer, der udgør den adrenal cortex og medulla. Denne protokol er en standard i vores laboratorium for immunfarvning med flere antistoffer rutinemæssigt anvendes i vores forskning.

Protocol

Alle metoder blev udført i overensstemmelse med institutionelt godkendte protokoller under auspicier Universitet Udvalget om brug og pleje af dyr på University of Michigan. 1. forberedelse til operation På dagen forud for operationen, forberede 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) / fosfatbufferet saltopløsning (PBS). I tilfælde af frosne delprøver, fortsætte med at optø en og opbevares ved 4 ° C.Bemærk: 4% PFA er ikke stabil i mere end 48 timer.Forsigtig: PFA er giftige, undg?…

Representative Results

Figur 1 repræsenterer en skematisk af hele protokollen beskrevet ovenfor. Binyrerne er høstet fra mus, tilstødende fedtvæv fjernes under et dissekere mikroskop og adrenal er så fast i 4% PFA. Efter dette trin, er binyrer behandlet og indlejret i paraffin, og snit med en mikrotom at skære orglet i tynde skiver, der er deponeret på objektglas. Efter tørring af sektionerne, immunofluorescens udføres, og sektionerne er afbildet på mikroskopet. <p cl…

Discussion

Denne protokol beskriver en metode til isolering af musen binyrerne sammen med udarbejdelsen og farvning af sektioneret paraffin-embedded mus binyrer.

I forhold til andre protokoller, vi testede, bevist protokollens immunofluorescens egnet til fleste af antistoffer bruges i vores laboratorium. Det kan dog i visse tilfælde kræve nogle justeringer til at forbedre farvning resultaterne. En variabel, der kan nemt redigeres og testet er længden af fiksering. I vores laboratorium, inkubation i 4%…

Materials

24-well cell culture plate	Nest Biotechnology Co.	0412B
Disposable needles 25Gx5/8"	Exel International	26403
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Paraplast plus	McCormik scientific	39502004	Paraffin for tissue embedding
Shandon biopsy cassettes II with attached lid	Thermo scientific	1001097	Cassettes for tissue processing
High Profile Microtome Blades	Accu-Edge	4685	Disposable stainless steel blades
Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds	Polysciences Inc.	18986	Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15	75x25x1 mm
Xylene	Fisher Chemical	X5P1GAL
200 Proof Ethanol	Decon Labs, Inc.
Certi-Pad Gauze pads	Certified Safety Mfg, Inc	231-210	3"x3. Sterile latex free gauze pads
M.O.M kit	Vector laboratories	BMK-2202	For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue
KimWipes	Kimtech	34155	Wipes 4.4×8.4 inch
Super PAP PEN	Invitrogen	00-8899	Pen to draw on slides
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544-D	Size: 22x50x1.5
DAPI	Sigma	D9542	(Prepared in 20mg/mL stock)
ProLong Gold antifade reagent	Molecular Probes	P36930	Mounting agent for immunofluorescence
X-cite series 120Q	Lumen Dynamics		Light source
Coolsnap Myo	Photometrics		Camera
Optiphot-2	Nikon		Microscope
microtome	Americal Optical
Tissue embedder	Leica	EG1150 H
Tissue processor	Leica	ASP300S
Normal goat serum	Sigma	G9023
Mouse anti-TH	Millipore	MAB318	Primary antibody
Rabbit anti-SF1	Ab proteintech group (PTGlabs)	custom made	Primary antibody
Alexa-488 Mouse IgG  raised goat	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Secondary antibody
Dylight-549 Rabbit IgG raised goat	Jackson ImmunoResearch	111-505-003	Secondary antibody
Citrate acid anhydrous	Fisher Chemical	A940-500
NIS-Elements Basic Research	Nikon		Software for imaging