Afzondering, fixatie en immunofluorescentie beeldvorming van muis bijnieren
Summary
Hier presenteren we een methode om te isoleren van de bijnieren van muizen, repareren de weefsels, sectie hen en uitvoeren immunofluorescentie kleuring.
Abstract
Immunofluorescentie is een gevestigde techniek voor de detectie van antigenen in weefsel met de tewerkstelling van fluorescerende-geconjugeerde antilichamen en heeft een breed spectrum van toepassingen. Detectie van antigenen zorgt voor karakterisering en de identificatie van meerdere celtypen. Gelegen boven de nieren en ingekapseld door een laag mesenchymale cellen, is de bijnier een endocriene orgel, gecomponeerd door twee verschillende weefsels met verschillende embryologische oorsprong, de mesonephric tussentijdse mesoderm afkomstige buitenste cortex en de neurale Crest-afgeleide innerlijke medulla. De bijnierschors scheidt steroïden (dat wil zeggen, mineralocorticoids, glucocorticoïden, geslachtshormonen) Overwegende dat de medulla bijnier catecholamines (dat wil zeggen, adrenaline, noradrenaline produceert). Terwijl de bijnier onderzoek, is het belangrijk om te kunnen onderscheiden van unieke cellen met verschillende functies. Hier bieden we een protocol ontwikkeld in ons laboratorium dat een reeks opeenvolgende stappen die nodig zijn beschrijft voor het verkrijgen van de immunofluorescentie kleuring te karakteriseren van de celtypes van de bijnier. Eerst richten we ons op de dissectie van de muis bijnieren, de microscopische verwijdering van vet van periadrenal gevolgd door de fixatie, verwerking en paraffine inbedding van het weefsel. Vervolgens beschrijven we afdelen van het weefsel blokken met een roterende microtoom. Tot slot, we detail een protocol voor immunefluorescentie verkleuring van de bijnieren die we hebben ontwikkeld om te minimaliseren van zowel de niet-specifieke antilichaam binding en de autofluorescence met het oog op een optimale signaal.
Introduction
Immunohistochemistry is een techniek voor het opsporen van weefsel componenten met het gebruik van antilichamen tegen specifieke cellulaire moleculen en latere kleuring technieken te detecteren de geconjugeerde antilichamen1. Deze procedure immunohistochemische vereist specifieke fixatie en verwerking van weefsels die vaak empirisch bepaald voor het specifieke antigeen, weefsel en antilichaam gebruikt2. Fixatie is van cruciaal belang voor het behoud van de “originele” toestand van het weefsel en daardoor handhaven intact cellulaire en subcellular structuren en expressiepatronen. Verdere zijn verwerking en procedures te embedding verplicht te stellen van het weefsel voor segmenteren in dunne plakjes, die worden gebruikt voor histologische studies waarbij immunohistochemistry.
Immunokleuring kan worden uitgevoerd met chromogenic of fluorescerende detectie. Chromogenic detectie vereist het gebruik van een enzym een oplosbare substraat omzetten in een onoplosbare gekleurde product. Terwijl dit enzym kan worden geconjugeerd met het herkennen van het antigeen (primair antilichaam) antilichaam, is het vaker geconjugeerd met het herkennen van het primaire antilichaam (dat wil zeggen, het secundaire antilichaam) antilichaam. Deze techniek is zeer gevoelig; de gekleurde product dat verkregen wordt uit de enzymatische reactie is van photostable en vereist alleen een helderveld Microscoop voor imaging. Echter chromogenic immunokleuring mogelijk niet geschikt wanneer het proberen om te visualiseren van twee eiwitten die mede lokaliseren, aangezien de afzetting van één kleur de afzetting van de andere maskeren kan. In het geval van co kleuring, heeft immunofluorescentie bewezen voordeliger. De komst van immunofluorescentie wordt toegeschreven aan Albert Coons en collega’s, die een systeem ontwikkelde voor het identificeren van weefsel antigenen met antistoffen gemarkeerd met fluoresceïne en hen visualiseren in het verdeelde weefsels onder ultraviolet licht3. Fluorescentie detectie is gebaseerd op een met een fluorophore die licht na excitatie uitzendt geconjugeerd antilichaam. Omdat er verschillende fluorophores met emissies bij verschillende golflengtes (met weinig of geen overlapping), deze detectiemethode is ideaal voor de studies van meerdere eiwitten.
De bijnier is een gepaarde orgaan gelegen boven de nieren en gekenmerkt door twee embryologisch afzonderlijke componenten, omgeven door een mesenchymale capsule. De buitenste bijnierschors, afgeleid van de mesonephric van de tussenliggende mesoderm, scheidt steroïdhormonen terwijl de innerlijke medulla, afgeleid van de neurale crest, produceert catecholamines waaronder adrenaline, noradrenaline en dopamine. De bijnierschors wordt histologisch en functioneel opgedeeld in drie concentrische zones, met elke zone verschillende klassen van steroïdhormonen afscheidende: de buitenste zona glomerulosa (zG) produceert mineralocorticoids die elektroliet homeostase regelen en intravasculaire volume; de middelste zona fasciculata (zF), scheidt direct onder de zG, glucocorticoïden die de stressrespons via de mobilisatie van energie winkels bemiddelen te verhogen van plasma glucose; en de innerlijke zona reticularis (zR), die synthetiseert sex steroïde precursoren (dat wil zeggen, Dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Afwisseling in adrenocortical zonering aanwezig tussen soorten is: bijvoorbeeld, Mus musculus ontbreekt de zR. De unieke postnatale X-zone van M. musculus is een overblijfsel van de foetale cortex gekenmerkt door kleine lipide-armen cellen met acidophilic cytoplasms5. De X-zone verdwijnt in de puberteit in mannelijke muizen en na de eerste zwangerschap in vrouwelijke muizen of geleidelijk ontaardt in niet-gefokt vrouwtjes6,7. Bovendien, de tortuosity en de dikte van de zG exposities gekenmerkt variatie tussen soorten zoals organisatie van perifere stuurpen en voorlopercellen cellen in en grenzend aan de zG. De rat, in tegenstelling tot andere knaagdieren, heeft een zichtbare ongedifferentieerde zone (zU) tussen de zG en zF die functioneert als een zone van de cel van de stam en/of een zone van voorbijgaande aard progenitoren frequentiebanden te versterken. De zU is uniek voor ratten of gewoon een meer georganiseerde prominent cluster van cellen is onbekend8,9.
Cellen van de bijnierschors lipide druppeltjes die slaan cholesterol esters die als de voorloper van alle steroïdhormonen10,11 dienen. De term “steroidogenesis” definieert het procedé van vervaardiging van steroïdhormonen uit cholesterol via een reeks enzymatische reacties die betrekking hebben op de activiteit van steroidogenic factor 1 (SF1), waarvan de expressie een marker van steroidogenic potentieel is. In de bijnier is Sf1 expressie alleen in de cellen van de cortex12aanwezig. Een interessant onderzoek gevonden de uitdrukking van endogene Biotine in de adrenocortical cellen met steroidogenic potentiële13. Hoewel dit kan de oorzaak van een hogere achtergrond in Biotine/streptavidine gebaseerde kleuring methoden, als gevolg van de opsporing van endogene Biotine door antilichaam geconjugeerd met daar, kon dit kenmerk ook worden gebruikt om te onderscheiden van de steroidogenic cellen uit andere populaties in de bijnier, dat wil zeggen, endotheel, kapselvorming en medulla cellen.
De medulla bijnier wordt geïnnerveerd door sympathieke preganglionic neuronen, en wordt gekenmerkt door basofiele cellen met een korrelig cytoplasma met adrenaline en noradrenaline. Medulla cellen heten “chromaffin” als gevolg van het hoge gehalte aan catecholaminen die een bruin pigment na oxidatie14 vormen. Tyrosine hydroxylase (TH) is het enzym dat katalyseert de snelheidslimieten stap in de synthese van catecholamines en in de bijnier, alleen in de medulla15wordt uitgedrukt.
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van muis bijnieren, de verwerking ervan voor het inbedden in paraffine en segmenteren, en een methode voor het uitvoeren van immunofluorescentie kleuring op bijnier secties teneinde de cellulaire typen vormen de bijnierschors en medulla. Dit protocol is een standaard in ons laboratorium voor immunokleuring met meerdere antilichamen routinematig gebruikt in ons onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van de bijnieren muis samen met de voorbereiding en verkleuring van de verdeelde paraffine-ingebedde muis bijnieren.
Vergeleken met andere protocollen die we getest, heeft dit immunofluorescentie protocol geschikt voor de meerderheid van de antilichamen gebruikt in ons laboratorium bewezen. In bepaalde gevallen kan het echter enkele aanpassingen om de kleuring resultaten te verbeteren. Een variabele die gemakkelijk kan worden bewerkt en gete…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr Mohamad Zubair voor zijn nuttige suggesties en technische bijstand bij de opstelling van dit protocol. Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van Diabetes en de spijsverterings en nierziekten, nationale instituten van gezondheid onderzoeksbeurs 2R01-DK062027 (voor G.D.H).
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. . Stevens & Lowe’s Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
