Isolation, Fixation et l’Immunofluorescence imagerie des glandes surrénales de souris

Summary

Nous présentons ici une méthode pour isoler les glandes surrénales de souris, difficulté les tissus, leur section et effectuez l’immunofluorescence souillant.

Abstract

Immunofluorescence est une technique bien établie pour la détection des antigènes dans les tissus avec l’emploi d’anticorps conjugués fluorochrome et dispose d’un large éventail d’applications. Détection d’antigènes permet la caractérisation et l’identification de plusieurs types de cellules. Située au-dessus des reins et encapsulé par une couche de cellules mésenchymateuses, la glande surrénale est un organe endocrine composé de deux tissus différents avec différentes origines embryologiques, le cortex externe mésonéphriques dérivés mesoderm intermédiaire et les neurones medulla interne dérivée de crête. La corticosurrénale sécrète des stéroïdes (c.-à-d., les minéralocorticoïdes, glucocorticoïdes, hormones sexuelles), tandis que la médullosurrénale produit des catécholamines (c.-à-d., adrénaline, noradrénaline). En effectuant une recherche surrénalienne, il est important d’être capable de distinguer les cellules uniques avec des fonctions différentes. Ici, nous fournissons un protocole mis au point dans notre laboratoire qui décrit une série d’étapes séquentielles requises pour l’obtention d’immunofluorescence souillant pour caractériser les types de cellules de la glande surrénale. Nous nous concentrons d’abord sur la dissection des souris les glandes surrénales, l’élimination microscopique des graisses periadrenal suivie de la fixation, le traitement et la paraffine incorporant des tissus. Nous décrivons ensuite la découpe des blocs de tissus avec un microtome rotatif. Enfin, nous détaillons un protocole pour l’immunofluorescence des glandes surrénales que nous avons élaborée pour minimiser les anticorps non-spécifiques et autofluorescence afin d’obtenir un signal optimal.

Introduction

Immunohistochemistry est une technique de détection de composants tissulaires avec l’utilisation d’anticorps dirigés contre des molécules cellulaires spécifiques et des techniques de coloration ultérieures pour détecter les anticorps conjugués¹. Cette procédure d’immunohistochemical nécessite une fixation spécifique et traitement des tissus qui sont souvent empiriquement déterminées pour l’antigène spécifique, les tissus et les anticorps utilisés². La fixation est essentielle préserver l’état « original » du tissu et ainsi maintenir intact cellulaires et des structures subcellulaires et profils d’expression. Plus de traitement et d’incorporation des procédures sont tenus de préparer le tissu pour la coupe en tranches fines qui sont utilisés pour les études histologiques concernant l’immunohistochimie.

Immunomarquage peut être effectuée avec détection chromogénique ou fluorescente. Détection chromogénique nécessite l’utilisation d’une enzyme pour convertir un substrat soluble en un produit coloré insoluble. Alors que cette enzyme peut se conjuguer à l’anticorps reconnaissant l’antigène (anticorps primaire), il est plus souvent conjugué à l’anticorps reconnaissant l’anticorps primaire (c.-à-d., l’anticorps secondaire). Cette technique est très sensible ; le produit coloré résultant de la réaction enzymatique est photostable et nécessite seulement un microscope à fond clair pour l’imagerie. Cependant, immunomarquage chromogène peut ne pas convenir lorsque vous essayez de visualiser deux protéines qui co localiser, étant donné que la déposition d’une couleur peut masquer la déposition de l’autre. Dans le cas des taches, immunofluorescence s’est avéré pour être plus avantageux. L’avènement de l’immunofluorescence est attribuée à Albert Coons et ses collègues, qui a mis au point un système permettant d’identifier les antigènes de tissu avec des anticorps marqués à la fluorescéine et les visualiser dans les tissus sectionnés sous lumière ultraviolette³. Détection de fluorescence est issue d’un anticorps conjugué avec un fluorophore qui émet de la lumière après excitation. Parce qu’il y a plusieurs fluorophores avec des émissions aux longueurs d’onde différentes (avec peu ou pas de chevauchement), cette méthode de détection est idéale pour l’étude des protéines multiples.

La glande surrénale est un organe jumelé situé au-dessus du rein et se caractérise par deux éléments Embryologiquement distinctes, entourés par une capsule mésenchymateuse. Le cortex surrénalien externe, dérivé du mésoderme intermédiaire mésonéphriques, sécrète des hormones stéroïdes alors que la médullaire interne, dérivée de la crête neurale, produit des catécholamines dont l’adrénaline, la noradrénaline et la dopamine. Le cortex surrénalien est histologiquement et fonctionnellement divisé en trois zones concentriques, chaque zone sécrétant des différentes classes d’hormones stéroïdes : la zone extérieure glomérulée (zG) produit des minéralocorticoïdes qui régulent l’homéostasie de l’électrolyte et volume intravasculaire ; le milieu zona fasciculata (zF), directement sous le zG, sécrète des glucocorticoïdes médiateurs de la réponse au stress par la mobilisation des réserves énergétiques pour augmenter le taux de glucose plasmatique ; et les reticularis de zona interne (zR), qui synthétise le sexe précurseurs stéroïdes (c.-à-d., la déhydroépiandrostérone (SDHEA))⁴.

Certaines variations dans la corticosurrénale zonation sont présente entre les espèces : par exemple, Mus musculus manque le zR. L’unique zone X postnatale de M. musculus est un vestige du cortex foetal caractérisé par des petites cellules pauvres en lipides avec cytoplasmes acidophiles⁵. La zone X disparaît à la puberté chez les souris mâles et après la première grossesse chez les souris femelles, ou dégénère progressivement dans les femelles de race n’est pas^6,7. En outre, la tortuosité et l’épaisseur des pièces zG marqué la variation entre les espèces comme le fait l’Organisation des cellules souches et progénitrices périphériques dans et à côté de la zG. Le rat, à la différence des autres rongeurs, dispose d’une zone visible indifférenciée (zU) entre le zG et zF qui fonctionne comme une zone de cellules souches et/ou une zone transitoire amplifier les progéniteurs. Si la zone d’incertitude est unique à des rats ou simplement plus organisés en évidence amas de cellules sont inconnue^8,9.

Les cellules du cortex surrénal contiennent des gouttelettes de lipides qui stockent des esters de cholestérol qui servent comme le précurseur de toutes les hormones stéroïdes^10,11.  Le terme « stéroïdogenèse » définit le processus de production des hormones stéroïdes de cholestérol via une série de réactions enzymatiques qui impliquent l’activité du facteur stéroïdogénique 1 (SF1), dont l’expression est un marqueur potentiel stéroïdogènes. Dans la glande surrénale, expression Sf1 est présente uniquement dans les cellules du cortex¹². Une étude intéressante a trouvé l’expression de la biotine endogène dans les cellules corticosurrénales avec potentiel stéroïdogène¹³. Tandis que cela peut être la cause d’une formation supérieure en méthodes de coloration basé/streptavidine-biotine, en raison de la détection de biotine endogène par l’anticorps conjugué avec la Streptavidine, cette caractéristique pourrait être aussi employée pour distinguer le stéroïdogènes cellules des autres populations au sein de la glande surrénale, c.-à-d., endothélial, capsulaire et cellules de la moelle.

Innervé par les neurones préganglionnaires sympathiques, la médullosurrénale est caractérisée par des cellules basophiles avec un cytoplasme granulaire contenant de l’épinéphrine et la norépinéphrine. Cellules de la moelle sont nommés « chromaffines » en raison de la forte teneur des catécholamines qui forment un pigment brun après oxydation¹⁴. Tyrosine hydroxylase (TH) est l’enzyme qui catalyse l’étape cinétiquement limitante dans la synthèse des catécholamines et, dans la glande surrénale, s’exprime uniquement dans la médulla¹⁵.

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des glandes surrénales de souris, leur traitement pour l’enrobage de paraffine et de sectionnement et une méthode pour exécuter immunofluorescence souillant sur sections surrénales afin d’identifier les types cellulaires qui constituent la cortex surrénal et la moelle. Ce protocole est une norme dans notre laboratoire pour l’immunohistochimie avec des anticorps multiples utilisés couramment dans nos recherches.

Protocol

Toutes les méthodes ont été réalisés conformément aux protocoles approuvés sur le plan institutionnel sous les auspices du Comité universitaire sur l’utilisation et l’entretien des animaux à l’Université du Michigan. 1. préparation pour la chirurgie Le jour avant la chirurgie, préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) / tampon phosphate salin (PBS). Dans le cas des aliquotes congelés, procéder à un dégel et conserver à 4 ° C.NOTE : 4 % PFA n’est pas stable p…

Representative Results

La figure 1 représente une représentation schématique de l’ensemble du protocole décrit ci-dessus. Les glandes surrénales sont récoltées de souris, adjacent de tissus adipeux est enlevé sous un microscope à dissection et les surrénales sont ensuite fixés à 4 % PFA. Après cette étape, les glandes surrénales sont traitées et incorporés à la paraffine et sectionnés avec un microtome permettant de couper l’orgue en fines tranches qui sont d…

Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour l’isolement des glandes surrénales de souris ainsi que de la préparation et la coloration des glandes surrénales de souris de paraffine sectionnés.

Comparé à d’autres protocoles que nous avons testé, ce protocole immunofluorescence s’est avéré convenant à la plupart des anticorps utilisés dans notre laboratoire. Toutefois, dans certains cas, il peut exiger des ajustements pour améliorer les résultats de coloration. Une variable qui peut…

Materials

24-well cell culture plate	Nest Biotechnology Co.	0412B
Disposable needles 25Gx5/8"	Exel International	26403
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Paraplast plus	McCormik scientific	39502004	Paraffin for tissue embedding
Shandon biopsy cassettes II with attached lid	Thermo scientific	1001097	Cassettes for tissue processing
High Profile Microtome Blades	Accu-Edge	4685	Disposable stainless steel blades
Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds	Polysciences Inc.	18986	Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15	75x25x1 mm
Xylene	Fisher Chemical	X5P1GAL
200 Proof Ethanol	Decon Labs, Inc.
Certi-Pad Gauze pads	Certified Safety Mfg, Inc	231-210	3"x3. Sterile latex free gauze pads
M.O.M kit	Vector laboratories	BMK-2202	For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue
KimWipes	Kimtech	34155	Wipes 4.4×8.4 inch
Super PAP PEN	Invitrogen	00-8899	Pen to draw on slides
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544-D	Size: 22x50x1.5
DAPI	Sigma	D9542	(Prepared in 20mg/mL stock)
ProLong Gold antifade reagent	Molecular Probes	P36930	Mounting agent for immunofluorescence
X-cite series 120Q	Lumen Dynamics		Light source
Coolsnap Myo	Photometrics		Camera
Optiphot-2	Nikon		Microscope
microtome	Americal Optical
Tissue embedder	Leica	EG1150 H
Tissue processor	Leica	ASP300S
Normal goat serum	Sigma	G9023
Mouse anti-TH	Millipore	MAB318	Primary antibody
Rabbit anti-SF1	Ab proteintech group (PTGlabs)	custom made	Primary antibody
Alexa-488 Mouse IgG  raised goat	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Secondary antibody
Dylight-549 Rabbit IgG raised goat	Jackson ImmunoResearch	111-505-003	Secondary antibody
Citrate acid anhydrous	Fisher Chemical	A940-500
NIS-Elements Basic Research	Nikon		Software for imaging