अलगाव, निर्धारण, और माउस अधिवृक्क ग्रंथियों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग
Summary
यहाँ हम चूहों से अधिवृक्क ग्रंथियों को अलग करने के लिए एक विधि वर्तमान, ऊतकों को ठीक, उन्हें अनुभाग, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन.
Abstract
इम्यूनोफ्लोरेसेंस fluorochrome-संयुग्मित एंटीबॉडी के रोजगार के साथ ऊतकों में एंटीजन का पता लगाने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है और आवेदनों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम है । एंटीजन का पता लगाने के लक्षण वर्णन और एकाधिक कोशिका प्रकार की पहचान के लिए अनुमति देता है । गुर्दे के ऊपर स्थित है और mesenchymal कोशिकाओं की एक परत से समझाया, अधिवृक्क ग्रंथि एक अंत में अलग embryological मूल के साथ दो अलग ऊतकों द्वारा रचित अंग है, mesonephric मध्यवर्ती मध्य त्वक स्तर-व्युत्पंन बाहरी प्रांतस्था और तंत्रिका शिखा-भीतरी मज्जा व्युत्पंन । अधिवृक्क प्रांतस्था स्टेरॉयड स्रावित करता है (यानी, mineralocorticoids, ग्लुकोकोर्तिकोइद, सेक्स हार्मोन), जबकि अधिवृक्क मज्जा उत्पादन catecholamines (यानी, एड्रेनालाईन, noradrenaline). अधिवृक्क अनुसंधान का संचालन करते समय, यह विभिन्न कार्यों के साथ अद्वितीय कोशिकाओं को भेद करने में सक्षम होना करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम एक हमारी प्रयोगशाला में विकसित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो कि अधिवृक्क ग्रंथि के सेल प्रकार की विशेषता के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्राप्त करने के लिए आवश्यक क्रमिक चरणों की एक श्रृंखला का वर्णन करता है. हम माउस अधिवृक्क ग्रंथियों के विच्छेदन पर पहले ध्यान केंद्रित, periadrenal वसा के सूक्ष्म हटाने के निर्धारण, प्रसंस्करण और ऊतक के तेल embedding द्वारा पीछा किया । हम तो एक रोटरी microtome के साथ ऊतक ब्लॉकों के खंड का वर्णन । अंत में, हम विस्तार अधिवृक्क ग्रंथियों के धुंधला immunofluorescent के लिए एक प्रोटोकॉल है कि हम दोनों गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी और autofluorescence को कम करने के लिए एक इष्टतम संकेत प्राप्त करने के लिए विकसित किया है ।
Introduction
Immunohistochemistry विशिष्ट सेलुलर अणुओं और बाद में धुंधला तकनीक को संयुग्मित एंटीबॉडी1का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग के साथ ऊतक घटकों का पता लगाने के लिए एक तकनीक है । इस immunohistochemical प्रक्रिया विशिष्ट निर्धारण और अक्सर विशिष्ट प्रतिजन, ऊतक और एंटीबॉडी2का उपयोग करने के लिए निर्धारित empirically है कि ऊतकों के प्रसंस्करण की आवश्यकता है । निर्धारण के लिए ऊतक के “मूल” राज्य के संरक्षण और इस तरह बरकरार सेलुलर और सेलुलर संरचनाओं और अभिव्यक्ति पैटर्न को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा प्रसंस्करण और embedding प्रक्रियाओं histologic immunohistochemistry शामिल अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है कि पतले स्लाइस में अनुभाग के लिए ऊतक तैयार करने के लिए आवश्यक हैं.
Immunostaining या तो chromogenic या फ्लोरोसेंट पता लगाने के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । Chromogenic का पता लगाने के लिए एक घुलनशील सब्सट्रेट एक अघुलनशील रंग का उत्पाद में परिवर्तित करने के लिए एक एंजाइम के उपयोग की आवश्यकता है । हालांकि इस एंजाइम को प्रतिजन (primary एंटीबॉडी) पहचानने वाले एंटीबॉडी को संयुग्मित किया जा सकता है, लेकिन यह एंटीबॉडी पहचानने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी, द्वितीयक एंटीबॉडी) को अधिक बार संयुग्मित है । यह तकनीक अति संवेदनशील है; रंगीन उत्पाद एंजाइमी प्रतिक्रिया से उत्पंन photostable है और इमेजिंग के लिए केवल एक brightfield माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है । हालांकि, chromogenic immunostaining उपयुक्त नहीं हो सकता है जब दो प्रोटीन की कल्पना करने की कोशिश कर रहा है कि सह स्थानीयकरण, एक रंग के जमाव के बाद से एक दूसरे के जमाव मुखौटा कर सकते हैं । सह-दाग के मामले में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस अधिक लाभप्रद साबित हुआ है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस के आगमन अल्बर्ट कूनों और सहकर्मियों, जो एक प्रणाली fluorescein के साथ चिह्नित एंटीबॉडी और उंहें पराबैंगनी प्रकाश3के तहत खोदी ऊतकों में कल्पना के साथ ऊतक प्रतिजनों की पहचान करने के लिए विकसित करने के लिए जिंमेदार ठहराया है । प्रतिदीप्ति पता लगाना एक fluorophore है कि उत्तेजना के बाद प्रकाश का उत्सर्जन करता है के साथ एक एंटीबॉडी संयुग्मित पर आधारित है । क्योंकि वहां विभिंन तरंग दैर्ध्य (कोई या थोड़ा ओवरलैप के साथ) में उत्सर्जन के साथ कई fluorophores हैं, इस का पता लगाने विधि कई प्रोटीन के अध्ययन के लिए आदर्श है ।
अधिवृक्क ग्रंथि एक बनती अंग गुर्दे के ऊपर स्थित है और दो embryologically अलग एक mesenchymal कैप्सूल से घिरा घटकों द्वारा विशेषता है । बाहरी अधिवृक्क प्रांतस्था, mesonephric मध्यवर्ती मध्य त्वक स्तर से व्युत्पंन, भीतर मज्जा, तंत्रिका शिखा से व्युत्पंन, जबकि स्टेरॉयड हार्मोन स्रावित करता है, एड्रेनालाईन सहित catecholamines का उत्पादन, noradrenaline, और डोपामाइन. अधिवृक्क प्रांतस्था histologically और कार्यात्मक तीन गाढ़ा क्षेत्रों में विभाजित है, प्रत्येक क्षेत्र के साथ स्टेरॉयड हार्मोन के विभिन्न वर्गों स्रावित: बाहरी zona glomerulosa (zG) mineralocorticoids कि विनियमित इलेक्ट्रोलाइट homeostasis का उत्पादन और intravascular मात्रा; मध्य zona fasciculata (zF), सीधे zG के नीचे, ग्लुकोकोर्तिकोइद कि ऊर्जा भंडार के जुड़ाव के माध्यम से तनाव प्रतिक्रिया मध्यस्थता के लिए प्लाज्मा ग्लूकोज को बढ़ाने के लिए स्राव; और भीतरी zona reticularis (zR), जो सेक्स स्टेरॉयड अग्रदूतों (यानी, dehydroepiandrosterone (DHEAS))4संश्लेषित ।
adrenocortical zonation में कुछ भिन्नता प्रजातियों के बीच मौजूद है: उदाहरण के लिए, मस musculus zR का अभाव है । एम musculus के अद्वितीय जन्मोत्तर एक्स-जोन भ्रूण प्रांतस्था acidophilic cytoplasms5के साथ छोटे लिपिड गरीब कोशिकाओं द्वारा विशेषता के एक अवशेष है । एक्स जोन पुरुष चूहों में यौवन पर गायब हो जाता है और मादा चूहों में पहली गर्भावस्था के बाद, या धीरे-2 नहीं नस्ल6,7में पतित. इसके अलावा, tortuosity और zG की मोटाई प्रजातियों के बीच भिंनता के रूप में चिह्नित के रूप में परिधीय स्टेम और जनक कोशिकाओं में और zG के निकट के संगठन करता है । चूहा, अंय कुतर के विपरीत, zG और zF के बीच एक दृश्य विभेदक क्षेत्र (zU) है कि एक स्टेम सेल जोन और/या क्षणिक बढ़ाना progenitors के एक क्षेत्र के रूप में कार्य करता है । चाहे zU चूहों के लिए अद्वितीय है या बस कोशिकाओं के एक अधिक प्रमुखता से संगठित क्लस्टर8,9अज्ञात है ।
अधिवृक्क प्रांतस्था की कोशिकाओं लिपिड बूंदों कि कोलेस्ट्रॉल एस्टर की दुकान है कि सभी स्टेरॉयड हार्मोन10,11के अग्रदूत के रूप में सेवा होते हैं. शब्द “steroidogenesis” एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला है कि steroidogenic फैक्टर 1 (SF1), जिसकी अभिव्यक्ति steroidogenic क्षमता का एक मार्कर है शामिल की एक सीरीज के माध्यम से स्टेरॉयड हार्मोन के उत्पादन की प्रक्रिया को परिभाषित करता है । अधिवृक्क ग्रंथि में, Sf1 अभिव्यक्ति केवल प्रांतस्था12की कोशिकाओं में मौजूद है । एक दिलचस्प अध्ययन में steroidogenic संभावित१३के साथ adrenocortical कोशिकाओं में अंतर्जात बायोटिन की अभिव्यक्ति पाई गई. हालांकि यह बायोटिन/streptavidin-आधारित धुंधला तरीकों में एक उच्च पृष्ठभूमि का कारण हो सकता है, streptavidin के साथ एंटीबॉडी संयुग्मित द्वारा अंतर्जात बायोटिन का पता लगाने के कारण, इस विशेषता भी steroidogenic भेद करने के लिए नियोजित किया जा सकता है अधिवृक्क ग्रंथि के भीतर अन्य आबादी से कोशिकाओं, यानी, endothelial, संपुटी, और मज्जा कोशिकाओं.
सहानुभूति preganglionic न्यूरॉन्स द्वारा Innervated, अधिवृक्क मज्जा कोशिका द्रव्य और एड्रेनालाईन युक्त एक दानेदार norepinephrine के साथ basophilic कोशिकाओं की विशेषता है. मज्जा कोशिकाओं का नाम है “chromaffin” catecholamines के उच्च सामग्री के कारण है कि ऑक्सीकरण14के बाद एक भूरे रंग वर्णक के रूप में । Tyrosine hydroxylase (गु) एंजाइम कि दर catalyzes catecholamines के संश्लेषण में कदम सीमित है और, अधिवृक्क ग्रंथि में, केवल मज्जा15में व्यक्त की है.
यहाँ हम चूहे अधिवृक्क ग्रंथियों के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, आयल और अनुभाग में embedding के लिए उनके प्रसंस्करण, और एक विधि के लिए गठित सेलुलर प्रकार की पहचान करने के क्रम में अधिवृक्क वर्गों पर धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन करने के लिए अधिवृक्क प्रांतस्था और मज्जा. इस प्रोटोकॉल कई एंटीबॉडी नियमित रूप से हमारे अनुसंधान में इस्तेमाल के साथ immunostaining के लिए हमारी प्रयोगशाला में एक मानक है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल की तैयारी और खोदी गई आयल-एंबेडेड माउस अधिवृक्क के धुंधला के साथ एक साथ माउस अधिवृक्क ग्रंथियों के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन है ।
अंय प्रोटोकॉल हम परीक्षण की तुलना में, इस इम्य…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल की स्थापना में अपने उपयोगी सुझावों और तकनीकी सहायता के लिए डॉ मोहम्द जुबैर का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे के रोगों के संस्थान, स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान 2R01 के राष्ट्रीय संस्थानों-DK062027 (जी. डी. एच.) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
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