Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse
Summary
Aqui nós apresentamos um método para isolar as glândulas adrenal de ratos, corrigir os tecidos, seção-los e executar a mancha da imunofluorescência.
Abstract
Imunofluorescência é uma técnica bem estabelecida para a detecção de antígenos nos tecidos com o emprego de anticorpos conjugados a fluorocromo e tem um amplo espectro de aplicações. Deteção de antígenos permite a caracterização e identificação de vários tipos de células. Situada acima dos rins e encapsulado por uma camada de células mesenquimais, a glândula adrenal é um órgão endócrino, composto por dois tecidos diferentes, com diferentes origens embriológicos, o córtex exterior derivados mesoderme intermediário mesonéfricos e o neural crista-derivado de medula interna. O córtex adrenal secreta esteroides (ou seja, mineralocorticoides, glicocorticoides, hormônios sexuais), enquanto a medula adrenal produz catecolaminas (i.e., adrenalina, noradrenalina). Durante a realização de pesquisa de adrenal, é importante ser capaz de distinguir células únicas com funções diferentes. Aqui nós fornecemos um protocolo desenvolvido em nosso laboratório que descreve uma série de etapas sequenciais, necessários para a obtenção de mancha da imunofluorescência para caracterizar os tipos de células da glândula adrenal. Nós focamos primeiro a dissecação das glândulas supra-renais do mouse, a remoção microscópica de gordura periadrenal, seguida da fixação, processamento e incorporação de parafina do tecido. Descrevemos em seguida com um micrótomo rotativo de corte dos blocos de tecido. Por último, detalhamos um protocolo para coloração imunofluorescente de glândulas supra-renais que temos desenvolvido para minimizar tanto a ligação de anticorpos inespecíficos e autofluorescência para alcançar uma óptima do sinal.
Introduction
Imuno-histoquímica é uma técnica para a detecção de componentes de tecido com o uso de anticorpos contra moléculas celulares específicas e técnicas de coloração subsequentes para detectar os anticorpos conjugados1. Este procedimento de imuno-histoquímica requer fixação específica e processamento de tecidos que são frequentemente empiricamente determinados para o antígeno específico, tecido e anticorpo utilizaram2. A fixação é crucial para preservar o estado “original” de tecido e, mantendo intacta celular e subcellular estruturas e padrões de expressão. Mais processamento e incorporação de procedimentos são necessários para preparar o tecido para corte em fatias finas que são usadas para estudos histológicos, envolvendo a imuno-histoquímica.
Immunostaining pode ser executada com deteção fluorescente ou cromogênica. A detecção cromogênica exige a utilização de uma enzima para converter um substrato solúvel em um produto colorido insolúvel. Enquanto esta enzima pode ser conjugada com o anticorpo reconhecer o antígeno (anticorpo primário), é mais frequentemente conjugado ao anticorpo reconhecendo o anticorpo primário (ou seja, o anticorpo secundário). Esta técnica é altamente sensível; o produto colorido resultante da reação enzimática é fotoestável e requer apenas um microscópio brightfield para a imagem latente. No entanto, cromogênico immunostaining pode não ser adequado ao tentar visualizar duas proteínas que co localizar, uma vez que a deposição de uma cor pode mascarar a deposição do outro. No caso de co coloração, imunofluorescência tem provado para ser mais vantajoso. O advento da imunofluorescência é atribuído a Albert Coons e colegas, que desenvolveram um sistema para identificar o tecido antígenos com anticorpos marcados com fluoresceína e visualizá-las nos tecidos sob luz ultravioleta3seccionados. Detecção de fluorescência é baseado em um anticorpo conjugado com um fluoróforo que emite luz após a excitação. Porque existem vários fluorophores com emissões em diferentes comprimentos de onda (com pouca ou nenhuma sobreposição), esse método de deteção é ideal para os estudos de várias proteínas.
A glândula adrenal é um órgão emparelhado localizada acima do rim e caracterizado por dois componentes distintos embryologically rodeadas por uma cápsula mesenquimal. O córtex adrenal exterior, derivado da mesoderma intermediária mesonéfricos, segrega hormonas esteroides, enquanto a medula interna, derivada da crista neural, produz catecolaminas, incluindo adrenalina, noradrenalina e dopamina. O córtex adrenal é histologicamente e funcionalmente dividido em três zonas concêntricas, com cada zona secretoras de classes diferentes de hormônios esteroides: o exterior zona glomerulosa (zG) produz mineralocorticoides que regulam a homeostase do eletrólito e volume intravascular; a médio zona fasciculada (zF), diretamente abaixo do zG, segrega glicocorticoides que medeiam a resposta ao estresse através da mobilização das lojas da energia para aumentar a glicose do plasma; e o interior zona reticular (zR), que sintetiza sexo precursores esteroides (ou seja, Dehidroepiandrosterona (DHEAS))4.
Alguma variação no zoneamento adrenocortical está presente entre as espécies: por exemplo, Mus musculus carece da zR. A única zona X pós-natal de M. musculus é um remanescente do córtex fetal, caracterizado por pequenas células de lipídios-pobres com acidofílicas cytoplasms5. A X-zone desaparece na puberdade em ratos do sexo masculinos e após a primeira gravidez em ratos fêmeas, ou gradualmente degenera em fêmeas de raça não6,7. Além disso, a tortuosidade e a espessura das exposições zG marcada variação entre espécies como organização de células tronco e progenitoras periféricas em e adjacente para o zG. O rato, ao contrário de outros roedores, tem uma zona de indiferenciadas visível (zU) entre o zG e zF que funciona como uma zona de células-tronco e/ou uma zona de transiente amplificando progenitores. Se o zU é exclusivo para ratos, ou simplesmente uma forma mais organizada com destaque aglomerado de células é desconhecido8,9.
Células do córtex adrenal contêm gotículas lipídicas que armazenam os ésteres de colesterol que servem como o precursor de todos os hormônios esteroides10,11. O termo “esteroidogênese” define o processo de produção de hormônios esteroides de colesterol através de uma série de reações enzimáticas que envolvem a atividade esteroidogênica fator 1 (SF1), cuja expressão é um marcador de potencial esteroidogênica. Na glândula adrenal, Sf1 expressão está presente apenas em células do córtex12. Um interessante estudo encontrou a expressão de biotina endógena adrenocortical células com potencial esteroidogênica13. Enquanto esta pode ser a causa da maior experiência em biotina/estreptavidina-com base em métodos de coloração, devido a detecção de biotina endógena pelo anticorpo conjugado com estreptavidina, esta característica pode ser também empregada para distinguir o esteroidogênica células de outras populações dentro da glândula adrenal, ou seja, endoteliais, capsular e células da medula.
Inervados pelo simpáticos neurônios preganglionic, a medula adrenal é caracterizada por basophilic células com uma citoplasma granular contendo epinefrina e norepinefrina. Células da medula são denominadas “cromafim” devido ao alto teor de catecolaminas que formam um pigmento marrom após oxidação14. Tirosina Hidroxilase (TH) é a enzima que catalisa a etapa limitante na síntese de catecolaminas e, na glândula adrenal, é expressa apenas na medula15.
Aqui nós apresentamos um protocolo para a isolação do rato as glândulas supra-renais, seu processamento para incorporação em parafina e corte e um método para realizar a mancha na adrenais seções a fim de identificar os tipos celulares que constituem o córtex adrenal e medula. Este protocolo é um padrão em nosso laboratório de imunocoloração com múltiplos anticorpos usados rotineiramente em nossa pesquisa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método para o isolamento de rato glândulas supra-renais juntamente com a preparação e coloração de glândulas supra-renais secionado rato de parafina.
Em comparação com outros protocolos que testamos, este protocolo de imunofluorescência revelou-se adequado para a maioria dos anticorpos utilizados em nosso laboratório. No entanto, em certos casos pode exigir alguns ajustes para melhorar os resultados da coloração. Uma variável que pode ser facilmente mod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Mohamad Zubair por suas sugestões úteis e assistência técnica no estabelecimento do presente protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e digestivo e doenças renais, institutos nacionais de saúde Research Grant 2R01-DK062027 (de Games).
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
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