Изоляция, фиксации и изображений иммунофлюоресценции мыши надпочечников
Summary
Здесь мы представляем метод, чтобы изолировать надпочечники от мышей, исправления тканей, раздел их и выполнять иммунофлюоресценции пятнать.
Abstract
Иммунофлюоресценции устоявшихся техника для выявления антигенов в ткани с занятостью флюрохром конъюгированных антител и имеет широкий спектр приложений. Определение антигенов позволяет характеристика и идентификации нескольких типов клеток. Расположенный выше почки и инкапсулируется слой мезенхимальных клеток, надпочечников является эндокринного органа входят два различных тканей с различными эмбрионального происхождения, Вольфов промежуточных производные мезодермы наружной коры головного мозга и нервных гребень производные внутренний продолговатого мозга. Надпочечников выделяет стероиды (то есть, mineralocorticoids, глюкокортикоидов, половые гормоны), тогда как мозгового вещества надпочечников производит катехоламинов (то есть, адреналин, норадреналин). Во время проведения исследования коры надпочечников, важно иметь возможность различать уникальный клетки с различными функциями. Здесь мы предоставляем протокол разработан в нашей лаборатории, который описывает ряд последовательных шагов, необходимых для получения иммунофлюоресценции пятнать характеризовать типы клеток надпочечников. Сначала мы ориентируемся на рассечение мыши надпочечных желез, микроскопические удаление жира periadrenal следуют фиксации, обработки и встраивание парафин ткани. Затем мы опишем, вырезание из блоков ткани с микротом роторный. И наконец мы подробно протокол для immunofluorescent окрашивание надпочечных желез, которые мы разработали для сведения к минимуму неспецифической антитела связывая и аутофлюоресценция для достижения оптимального сигнала.
Introduction
Иммуногистохимия — это метод для обнаружения компонентов ткани с использованием антител к конкретным сотовой молекулы и последующее окрашивание методы для обнаружения конъюгированных антител1. Эта процедура иммуногистохимических требует конкретной фиксации и обработки тканей, которые часто эмпирически установлено для специфического антигена, ткани и антитела используются2. Фиксация имеет решающее значение для сохранения «оригинал» состояние ткани и тем самым сохраняя нетронутыми сотовых и внутриклеточных структур и шаблоны выражений. Для подготовки ткани для разрезания тонкими ломтиками, которые используются для гистологического исследования, с участием иммуногистохимия необходимы дальнейшие обработки и внедрение процедур.
Иммуноокрашивания могут быть выполнены с хромогенных или флуоресцентные обнаружения. Хромогенный обнаружения требует использования фермент с конвертировать soluble подложка в нерастворимые цветные продукт. Хотя этот фермент может конъюгированных к антителу, признавая антигена (основное антитело), он чаще всего конъюгированных к антителу, признавая основное антитело (то есть, вторичное антитело). Эта техника очень чувствительна; Цветные продукта в результате ферментативной реакции фотостабилен и требует только brightfield микроскоп для воображения. Однако Хромогенный иммуноокрашивания могут не подходить при попытке визуализировать две белки, которые совместно локализации, так как осаждения одного цвета может маскировать осаждения другой. В случае совместного окрашивание, иммунофлюоресценции оказался более выгодным. С появлением иммунофлюоресценции приписывается Альберта Кунса и коллег, которые разработали систему для выявления антигенов в ткани с помеченные флюоресцеином антитела и визуализировать их в секционного тканях под ультрафиолетового света3. Флуоресценции обнаружения основан на антитело проспряганное с Флюорофор, который испускает свет после возбуждения. Потому что есть несколько флуорофоров с выбросами на разных длинах волн (с перекрытием нет или мало), этот метод обнаружения идеально подходит для исследования нескольких белков.
Надпочечников это Парный орган расположен выше почки и характеризуется двумя embryologically отдельных компонентов, окруженный капсулу мезенхимальных. Внешней коры надпочечников, производный от Вольфов промежуточных мезодермы, выделяет стероидных гормонов, в то время как внутренний мозгового вещества, производные от нейронные крест, производит катехоламинов, включая адреналина, норадреналина и дофамина. Надпочечников гистологически и функционально разделены на три концентрических зон, с каждой зоной, секреции различных классов стероидных гормонов: внешней zona glomerulosa (ЖГ) производит mineralocorticoids, которые регулируют электролитного гомеостаза и внутрисосудистого объема; средняя зона fasciculata (zF), непосредственно под zG, выделяет глюкокортикоидов, которые посредником стрессовой реакции путем мобилизации магазины энергии для повышения глюкозы плазмы; и Внутренняя зона reticularis (zR), которые синтезирует Секс стероидного прекурсоров (то есть, дегидроэпиандростерона (ДГЭАС))4.
Некоторые вариации в адренокортикальной зональности присутствует между видами: например, Mus musculus недостает zR. Уникальный послеродовой X-зоне м. musculus является пережитком плода коры характеризуется небольшой клетки липидов бедных с ацидофильной цитоплазматический5. X-zone исчезает в период полового созревания у мышей-самцов и после первой беременности у самок мышей, или постепенно вырождается в самок не разводят6,7. Кроме того извилистость и толщина zG экспонатов отмечены различия между видами как Организация периферических стволовых и прогениторных клеток в и прилегающие к zG. Крыса, в отличие от других грызунов, имеет видимый недифференцированные зоны (цу) между zG и zF что функции как стволовых клеток зоны или зоны переходных, усиливая прародителями. Ли цу является уникальным для крыс, или просто более четко организованной скопление клеток является неизвестным8,9.
Клетки коры надпочечников содержат липидного капель, содержащих холестерин эфиры, которые служат в качестве прекурсора всех стероидные гормоны10,11. Термин «стероидогенеза» определяет процесс производства стероидных гормонов из холестерина через серию ферментативных реакций, которые включают деятельность стероидогенных фактор 1 (SF1), выражением которого является маркером стероидогенных потенциал. В надпочечники Sf1 выражение присутствует только в клетках коры12. Интересные исследования нашли выражение эндогенный биотин в клетках коры надпочечников с стероидогенных потенциальных13. Хотя это может быть причиной повышенный фон на основе биотина/стрептавидина пятная методов, из-за обнаружения эндогенный биотин, антитело проспряганное с стрептавидина, эта характеристика может использоваться также различать стероидогенных клетки из других групп населения в пределах надпочечников, т.е., эндотелия, капсульного и клетки продолговатого мозга.
Иннервируются симпатических преганглионарных нейронов, мозгового вещества надпочечников характеризуется базофильная клетки с гранулированных цитоплазмой, содержащие адреналин и норадреналин. Продолговатый мозг клетки называются «хромаффинных» из-за высокое содержание катехоламинов, которые формируют коричневый пигмент после окисления14. Тирозин гидроксилазы (TH) является Фермент катализирует тариф ограничивая шаг в синтез катехоламинов и, надпочечников, выражается только в Продолговатый мозг15.
Здесь мы представляем собой протокол для изоляции мыши надпочечных желез, их обработки для встраивания в парафин и секционирование и метод для выполнения иммунофлюоресценции окрашивания на участках коры надпочечников с целью выявления клеточных типов составляющих надпочечников коры и мозгового вещества. Этот протокол является стандартом в нашей лаборатории для иммуноокрашивания с несколько антитела, которые регулярно используются в наших исследованиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод для изоляции мыши надпочечники вместе с подготовки и окрашивание секционного парафин врезанных мыши надпочечников.
По сравнению с другими протоколами, мы проверили, этот протокол иммунофлюоресценции доказал подходит для большинства анти?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Мохаммед Зубаир за его полезные предложения и техническую помощь в создании этого протокола. Эта работа была поддержана национального института диабета и пищеварения и болезни почек, национальные институты здравоохранения исследовательский грант 2R01-DK062027 (для G.D.H).
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. . Stevens & Lowe’s Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
