Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón
Summary
Aquí presentamos un método para aislar las glándulas suprarrenales de los ratones, reparar los tejidos, les sección y realizar tinción de inmunofluorescencia.
Abstract
La inmunofluorescencia es una técnica bien establecida para la detección de antígenos en los tejidos con el empleo de anticuerpos conjugados con fluorocromo y tiene un amplio espectro de aplicaciones. Detección de antígenos permite la caracterización y la identificación de múltiples tipos de células. Situado por encima de los riñones y encapsulado por una capa de células mesenquimales, la glándula suprarrenal es un órgano endocrino, compuesto por dos tejidos diferentes con diferente origen embriológico, la corteza externa de derivados del mesodermo intermediaria mesonephric y los nervios médula interna derivados de la cresta. La corteza suprarrenal segrega esteroides (es decir, mineralocorticoides, glucocorticoides, hormonas sexuales), mientras que la médula suprarrenal produce las catecolaminas (es decir, adrenalina, noradrenalina). Mientras realiza la investigación suprarrenal, es importante poder distinguir células únicas con diferentes funciones. Aquí proporcionamos un protocolo desarrollado en nuestro laboratorio que describe una serie de pasos secuenciales necesarios para obtención de tinción de inmunofluorescencia para caracterizar los tipos celulares de la glándula suprarrenal. Nos centramos primero en la disección de las glándulas suprarrenales de ratón, la eliminación microscópica del periadrenal grasa seguida de la fijación, la transformación y la inclusión en parafina de los tejidos. A continuación describimos de seccionamiento de los bloques de tejido con un micrótomo rotatorio. Por último, detallamos un protocolo para la tinción inmunofluorescente de las glándulas suprarrenales que hemos desarrollado para minimizar la Unión inespecífica del anticuerpo y autofluorescencia para obtener una señal óptima.
Introduction
Inmunohistoquímica es una técnica para la detección de componentes del tejido con el uso de anticuerpos contra moléculas celulares específicas y posteriores técnicas de tinción para detectar los anticuerpos conjugados1. Este procedimiento de inmunohistoquímica requiere fijación específica y procesamiento de los tejidos que están determinados a menudo empírico para el antígeno específico, tejidos y anticuerpos utilizados2. La fijación es crucial para preservar el estado “original” de los tejidos y manteniendo así intacta celular y estructuras subcelulares y patrones de expresión. Se necesitan adicionales de procesamiento y procedimientos de inclusión para preparar el tejido seccionado en rebanadas que se usan para estudios histológicos con inmunohistoquímica.
Inmunotinción puede realizarse con detección chromogenic o fluorescente. Detección cromógena requiere la utilización de una enzima para convertir un sustrato soluble en un producto coloreado insoluble. Mientras que esta enzima puede ser conjugada con el anticuerpo reconoce al antígeno (anticuerpo primario), más a menudo es conjugado con el anticuerpo que reconoce el anticuerpo primario (es decir, el anticuerpo secundario). Esta técnica es muy sensible; el producto coloreado que resultan de la reacción enzimática es Fotoestables y requiere sólo un microscopio de campo luminoso para la proyección de imagen. Sin embargo, immunostaining cromogénico puede no ser conveniente cuando se intenta visualizar dos proteínas que co localización, ya que la deposición de un solo color puede enmascarar la deposición de la otra. En el caso de coloración Co, inmunofluorescencia ha demostrado para ser más ventajosos. El advenimiento de la inmunofluorescencia se atribuye a Albert Coons y colegas, que desarrolló un sistema para identificar antígenos de tejidos con anticuerpos marcados con fluoresceína y visualizarlas en los tejidos seccionados bajo luz ultravioleta3. Detección de fluorescencia se basa en un anticuerpo conjugado con un fluoróforo que emite luz después de la excitación. Porque hay varios fluoróforos con emisiones en diferentes longitudes de onda (con poca o ninguna superposición), este método de detección es ideal para los estudios de múltiples proteínas.
La glándula suprarrenal es un órgano vinculado situado encima del riñón y caracterizado por dos componentes embriológicamente distintos rodeados por una cápsula mesenquimal. La corteza suprarrenal externa, derivada del mesodermo intermedio mesonephric, secretan hormonas esteroides mientras que la médula interna, derivada de la cresta neural, produce catecolaminas como adrenalina, noradrenalina y dopamina. La corteza suprarrenal se divide histológicamente y funcionalmente en tres zonas concéntricas, con cada zona secretoras de diferentes clases de hormonas esteroides: el exterior de la zona glomerular (zG) produce mineralocorticoides que regulan la homeostasis de electrolitos y volumen intravascular; la media de la zona fasciculada (zF), directamente debajo de la zG, segrega glucocorticoides que median la respuesta de estrés a través de la movilización de los almacenes de la energía para aumentar la glucosa en plasma; y la zona interna reticular (zR), que sintetiza precursores de esteroides (es decir, dehidroepiandrosterona (DHEAS))4.
Alguna variación en la zonación adrenocortical está presente entre las especies: por ejemplo, Mus musculus carece de la zR. La única zona X postnatal del M. musculus es un remanente de la corteza fetal caracterizado por pequeñas células pobres en lípidos con citoplasmas acidófilos5. La zona X desaparece en la pubertad en ratones machos y después del primer embarazo en ratones femeninos o degenera gradualmente en las hembras no crían6,7. Por otra parte, la tortuosidad y el espesor de los objetos expuestos de zG marcan variación entre las especies como la organización de las células madre y progenitoras periféricas en y adyacente a la zG. La rata, a diferencia de otros roedores, dispone de una zona indiferenciada visible (zU) entre la zG y zF que funciona como una zona de la célula de vástago o una zona de transitorios amplificando progenitores. El zU es único a las ratas o simplemente más prominente organizan grupo de células es desconocido8,9.
Las células de la corteza suprarrenal contienen gotitas de lípidos que almacenan los ésteres de colesterol que servir como el precursor de todas las hormonas esteroides10,11. El término “steroidogenesis” define el proceso de producción de las hormonas esteroides de colesterol a través de una serie de reacciones enzimáticas que involucran la actividad del factor steroidogenic 1 (SF1), cuya expresión es un marcador de potencial steroidogenic. En la glándula suprarrenal, Sf1 expresión sólo está presente en las células de la corteza12. Un interesante estudio encuentra la expresión de la biotina endógena en las células adrenocorticales con potencial steroidogenic13. Mientras que esto puede ser la causa de una mayor experiencia en métodos de tinción basada en biotina/estreptavidina, debido a la detección de la biotina endógena por el anticuerpo conjugado con estreptavidina, esta característica podría emplearse también para distinguir el steroidogenic células de otras poblaciones dentro de la glándula suprarrenal, es decir, endoteliales, capsular y las células de la médula.
Inervado por neuronas simpáticas preganglionares, la médula suprarrenal se caracteriza por células basófilas con un citoplasma granular que contiene epinefrina y norepinefrina. Las células de la médula se denominan “cromafines” debido al alto contenido de catecolaminas que forma un pigmento marrón después de oxidación14. Tirosina hidroxilasa (TH) es la enzima que cataliza el paso tarifa-limitador en la síntesis de catecolaminas y en la glándula suprarrenal, se expresa solamente en la médula15.
Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón, su proceso de inclusión en parafina de seccionamiento y un método para realizar la inmunofluorescencia que manchaba en suprarrenales secciones con el fin de identificar los tipos celulares que constituyen el corteza suprarrenal y la médula. Este protocolo es un estándar en nuestro laboratorio para la inmunotinción con anticuerpos múltiples rutinariamente utilizados en nuestra investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón junto con la preparación y tinción de las glándulas suprarrenales seccionado ratón embebido en parafina.
Comparado con otros protocolos que hemos probado, este protocolo de la inmunofluorescencia ha sido conveniente para la mayoría de los anticuerpos utilizados en nuestro laboratorio. Sin embargo, en algunos casos puede requerir algunos ajustes para mejorar los resultados de la tinción. Una v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias por sus sugerencias y asistencia técnica en el establecimiento de este protocolo Dr. Mohamad Zubair. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón, institutos nacionales de salud Research Grant 2R01-DK062027 (para G.D.H).
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
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