בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular
Summary
כאן אנו מציגים עבור מאתר ויוו תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular עם ביוטין פרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של החלבון עניין.
Abstract
פרוטאינוריה נובעת שיבוש המסנן glomerular המורכבת אנדותל fenestrated גלומרולרי במרתף, podocytes עם דיאפרגמות חריץ שלהם. המבנה העדין של המסנן glomerular, במיוחד הסרעפת שסע, מסתמכת על יחסי הגומלין של חלבונים פני שטח התא מגוונות. לומדים אלה חלבונים פני שטח התא כה הוגבלה במבחנה בלימודים או ניתוח היסטולוגית. כאן, אנו מציגים biotinylation מאתר ויוו תיוג שיטה, אשר מאפשר חקר חלבונים פני שטח התא glomerular בתנאים הפיזיולוגיות, pathophysiologic. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של חלבון עניין. כימות למחצה של שפע פני שטח התא glomerular ונותרות עם שיטה חדשנית זו, נגיש זלוף ביוטין כל החלבונים, ניתן יהיה ללמוד immunoprecipitation. בנוסף, בידוד של glomeruli עם או בלי biotinylation מאפשר עוד ניתוח של glomerular RNA, חלבון, כמו גם תרבית תאים glomerular הראשית (קרי, תרבית תאים של podocyte הראשית).
Introduction
פרוטאינוריה מהווה סימן היכר של פציעה glomerular ומלווה בדרך כלל שיבוש מסנן glomerular1. המסנן glomerular מורכב של אנדותל fenestrated, גלומרולרי במרתף, podocytes. המבנה המולקולרי העדין של המסנן glomerular היא דינמית מאוד על תאי הדם בבני אדם בשתי הכליות בריאים וחולים2,3,4,5,6 . אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא הוכח חיונית להישרדותו של podocytes7. Nephrin podocalyxin transmembrane חלבונים לידי ביטוי podocytes בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. Nephrin הוא עמוד השדרה של הסרעפת שסע glomerular, בעוד podocalyxin הוא sialoglycoprotein ציפוי תהליכי רגל משני podocytes8,9,10. סחר endocytic שהוצג בעבר עבור nephrin ו- podocalyxin3,11,12,13,14.
לפי מיטב ידיעתנו, אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא לא עוד תואר בתאי האנדותל glomerular בספרות. עם זאת, תאי אנדותל לבטא באופן כללי כל החלבונים הדרושים עבור סוגים שונים של אנדוציטוזה (קרי, אנדוציטוזה clathrin תלוית, תלויי-רפסודה)15,16. לכן, תאי אנדותל משטח סחר עשויים להילמד בשיטה זו משתמשים, לדוגמה, אנדותל כלי הדם (VE)-קדהרין, מולקולה אדהזיה תאיים (ICAM-2) כמו תא משטח סמן חלבון תאי אנדותל glomerular17 .
למרבה הצער, יש אין מודל מדויק במבחנה למסנן עדין שלוש שכבות glomerular בתא שבו הדם סחר יכול להילמד. המטרה של שיטה זו היא ובכך ללמוד חלבון glomerular סחר ויוו. בנוסף, פרוטוקול זה מכיל מידע על כיצד לבודד glomeruli, המאפשר ניתוח של glomerular RNA, חלבונים, או תאים. דומה בידוד glomerular טכניקות תוארו על ידי שונים קבוצות18,19.
בעבר, אנחנו ואחרים השתמשו שמחוץ תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular מאת biotinylation2,3,4,20,21. עם זאת, בשיטה זו שמחוץ , מבודד glomeruli נחשפו ללחץ מכני, העלולים להשפיע על סחר endocytic. לחלופין, immunofluorescence תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular בהרחבה שימש בספרות2,20,22. בשיטה זו, עם זאת, ניתן לנתח כמות קטנה של חלבונים בתוך שקופית אחת, כימות של immunofluorescence תמונות קשה לעיתים קרובות.
השיטה הרומן ויוו מציעה כלי אמין ללמוד glomerular תא הדם שפע וסחר במדויק בתוך בריאים וחולים הכליות, זה יכול לשמש כתוספת בדיקות immunofluorescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה הציג מאפשר בידוד מוצלחת של glomeruli לחקור glomerular RNA או החלבון. בנוסף, ניתן לבצע תרביות תאים glomerular הראשית glomeruli מבודד. אם ביוטין מוחל לפני glomerular בידוד, תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular יכולה להתבצע. בשיטה זו, אין ויוו glomerular תא הדם סחר יכול להילמד, כימות למחצה של חלבון שפע אפשרית. השלבים ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים Duvnjak בלנקה על סיוע טכני יוצא דופן שלה. עבודה זו נתמכה על ידי פתוח (www.dfg.de) WO1811/2-1 כדי M.W. ו- QU280/3-1 על מנת משכל Funder היה לא תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח נתונים, ההחלטה לפרסם ולאחר ההכנה של כתב היד.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein–nephrin–is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
