Her gir vi en arbeidsflyt som gjør identifisering av sunn og patologiske cellene basert på deres 3-dimensjonal form. Vi beskriver prosessen med å bruke 2D-projeksjon skisserer basert på 3D overflater for å trene kart Self-Organizing som gir objektive klynging av de undersøkte celle populasjonene.
Utseendet og bevegelser av immunceller er drevet av miljøet. Som en reaksjon på en patogen invasjon, immunceller er rekruttert til området av betennelse og aktiveres for å hindre en videre spredning av invasjonen. Dette gjenspeiles også av endringer i virkemåten og morfologiske utseende av immunceller. I kreft tissue, lignende morphokinetic endringer er observert i atferden til microglial celler: intra-tumoral microglia har mindre kompleks 3-dimensjonale figurer, har mindre forgrenet cellulære prosesser, og flytte raskere enn sunn vev. Undersøkelse av morphokinetic egenskaper krever kompleks 3D mikroskopi teknikker, som kan være svært utfordrende når henrettet langs. Derfor er opptak av en statisk 3D figur i en celle mye enklere, fordi dette krever ikke intravital mål og kan utføres på forbrukeravgift vev også. Men det er viktig å ha verktøy som tillater en rask og presis beskrivelse av 3D-figurer og lar diagnostiske klassifiseringen av sunn og patogene vevsprøver basert utelukkende på statisk, form-relatert informasjon. Her presenterer vi en verktøykasse som analyserer diskret Fourier komponentene av et sett med 2D anslag av 3D celle overflater via Self-Organizing kart. Bruk av kunstig intelligens metoder gjør vårt rammeverk for å lære om forskjellige celle figurer som det er brukt mer og mer vevsprøver, mens arbeidsflyten er enkel.
Rimelig, enkel og nøyaktig bestemmelse av patologisk status for biologisk vev er høyeste interessen for biomedisinsk forskning. Musen modeller gir midler til å studere en rekke pathological betingelser, for eksempel immunreaksjoner eller hudkreft, sammen med komplekse 3D og 4 D (3 romlige dimensjoner og tid) mikroskopi teknikker. Mikroskopi studier kan utføres via intravital eller forbrukeravgift vev 2-fotonet mikroskopi, lys arks mikroskopi, og å en begrenset vev dybde på ca 100 µm-ved AC confocal mikroskopi. For å få gang-relatert informasjon om cellene oppførsel under fysiologiske eller patologiske forhold, er det nødvendig å overvåke vevet i lengre tid, som vanligvis krever intravital tenkelig1,2 . Naturligvis, anvendelse av denne teknikken er begrenset til dyremodeller på grunn av sin invasiveness. Ikke-invasive teknikker er også tilgjengelig for menneskelig programmer, inkludert en rekke tomografi metoder (MSOT, CT, etc.), men disse metodene alle mangler nødvendige romlig- og ofte midlertidig løsning å studere atferden på cellenivå.
Statisk informasjon om utseendet av celler kan være tilgjengelige lettere via ulike 3D bildeprodukter teknikker kjøres på forbrukeravgift vevsprøver. Her kinetic virkemåten til cellene er ikke målt, derfor er det nødvendig å vedta romanen analyseteknikker som kan kontrollere patogene undersøkt cellene basert utelukkende på deres morfologi3. En slik tilnærming ble brukt til å knytte cellen figurer og vev teksturer til patologisk adferd4,5,6.
I den nye teknikken beskrevet her, cellene er rekonstruert som 3D flater og deres er preget via 3D til 2D anslag og påfølgende Fourier-baserte periferien-form analyse7,8. Ved å redusere dimensjonene fra 3 til 2, er problemet forenklet. Det er også mulig å karakterisere celle overflatene i 3D bruke sfærisk harmoniske analyse, som det har blitt gjort for medisinske bilder9. Imidlertid håndterer sfærisk harmoniske ikke skarpe og robust Vel, krever en multi-skala rutenettet skal etableres på enheten sfæren. I tillegg antallet nødvendige sfærisk harmoniske komponenter kan være store (50-70), med de underliggende beregningene svært krevende og resultatene vanskelig å tolke10,11,12.
Vår nylig foreslåtte metoden reduseres aktiviteten til en serie av 2D figurbeskrivelser, der antall 2D anslagene er opp analytiker og justeres etter kompleksiteten i 3D-form. Anslagene genereres automatisk via et Python-skript som kjører i en 3D-animasjon verktøyet. 2D anslagene er beskrevet av diskret Fourier transform (DFT) komponenter i deres periferi, beregnet av en Fiji13 plugin som tilbys her som en del av vår programvarepakke. DFT er brukt her for å dele opp komplekse omrisset av cellen inn i synd og cos funksjoner. På denne måten kan vi beskrive disposisjonen med et relativt lite antall DFT komponenter, dermed redusere kompleksiteten av problemet (for mer detaljer se ligninger avsnitt). DFT komponentene er satt i en utdannet Self-Organizing kart (SOM14), der eksistensen av figuren klynger kan objektivt testet8. Somer gir en konkurransedyktig og unsupervised læremiddel fra feltet av kunstig intelligens. De består av en koblet rekke kunstige nerveceller som kommuniserer med hverandre via en vektet nabolaget avstand funksjon. Neuronal systemet reagerer på det første elementet i input datasettet og neurons som svar er den sterkeste “gruppert” nærmere hverandre. Som neural systemet mottar mer input, begynner data nerveceller som gjentatte ganger reagerer sterkt å danne veldefinert klynge i systemet. Etter riktig trening på store datasett som inneholder 2D-figurinformasjon i form av et sett med DFT komponenter, enkeltstående cellers DFT komponenter kan settes i trent SOMEN og avsløre om cellen sannsynlig tilhører den sunne eller gruppen patogene cellen. Vi forventer slik verktøyet å bli et flott tillegg til metodene av vitenskapelig og klinisk diagnostikk.
Identifikasjon av potensielt patologiske forhold med små, intakt vevsprøver er høy viktighet. Slike teknikker vil sikre en betimelig respons infeksjonssykdommer og aggressiv typer kreft. Kinetic og morfologiske svarene på ulike immunceller, f.eks microglia og makrofager, er karakteristisk for immunforsvaret i kroppen. Selv i de fleste tilfeller ikke er det praktisk eller mulig å overvåke kinetic virkemåten til disse cellene, er det ganske enkelt hente 3-dimensjonale bilder for å hente sin form. Vanligvis anta immunceller en kompleks figur i friskt vev og en mye enklere form under betent eller kreft18. Mens tidsavhengige kjennetegner slik figur endring ville legge til vår forståelse av utviklingen av immunforsvaret, kan bruker bare 3D form av en representant cellegruppe også være tilstrekkelig å angi sunn eller patologisk av vev.
Karakterisere 3-dimensjonale overflaten av en celle er ikke en enkel oppgave. Bruk av sfæriske harmoniske er en måte å representere en 3D overflate med et relativt stort antall (50-70) komponenter11,12. I tillegg bestemme den sfæriske harmoniske er beregningsmessig dyrt; projisere svært komplekse figurer på enheten sfæren er enten umulig eller svært vanskelig på grunn av behovet for å bruke flere nett av ulike finhet på enheten sfæren; Endelig er meningsfull tolkningen av spectra sfærisk harmoniske komponentene langt fra ubetydelig.
I vårt arbeid som presenteres her, erstatte vi den vanskelige oppgaven med direkte 3D overflaten analyse med mye enklere tilnærming av bruker 2D projeksjoner av opprinnelige overflaten for å få tilstrekkelig morfologiske informasjon for å identifisere patologisk forhold. Vi viste hvert trinn av arbeidsflyten ved hjelp av 3D mikroskopi data fra myeloide celler, mens tydelig påpekte at alle trinnene var enkle å fullføre, og de resulterende 2-dimensjonal kartene var lett å tolke.
Naturligvis, en 3D-til-2D-projeksjon vil føre til tap av informasjon om strukturen på overflaten. I vårt eksempel datasett av microglia i en mus kortikale svulst modell var det nok til å bruke seks vinkler når du oppretter 2D anslagene. Men kan mer kompliserte figurer eller mindre fremtredende morfologiske endringer kreve at et større antall anslag er skapt for å identifisere pålitelig celle undergrupper med SOM. Derfor er vår tilnærming utformet for å kunne generere og analysere flere anslag. Ved å velge et høyere antall anslagene for mer komplekse figurer, er det mulig å skalere informasjonstap til et tålelig minimum. Som et eksempel, vil samspill celle type figur 4a og 4b kreve et større antall anslag for å representere komplekse overflaten riktig.
Som et omtrentlig metoden måtte herved foreslåtte arbeidsflyten testes mot resultatene av en manuell klassifisering prosess microglia18. Resultatene presentert tidligere bekreftet påliteligheten av automatiserte arbeidsflyten. Videre er arbeidsflyten mer tid effektiv sammenlignet med konvensjonelle analyse. Medisinsk ekspert som klassifisert microglia cellene manuelt nødvendig ca 4 uker for sin analyse av datasettet mens våre arbeidsflyt trengs bare ca 1 dag. Robust vår tilnærming ble også tydelig påvist av reproduserbarhet av utdannet SOMEN til et delsett med data som tilhørte samme celle type, men ble ikke brukt til å trene SOM, som vist i Figur 3 c.
Selv om vår tilnærming ikke vurdere kinetic informasjon, undersøkte vi effekten av timingen på DFT-baserte form analyse. Det vanligste eksemplet for tid avhengig atferd ble funnet blant befolkningen transportabel cellen der bidraget fra høyere indeksert DFT komponentene var tydelig observerbare, som i figur 4a. Dette krever oppmerksomhet til viktigheten av bruker et tilstrekkelig antall DFT komponenter når håndtere celletyper som er sannsynlig å oppføre seg på en svært tidsavhengige måte. Automatisert natur og høy kjøringen av våre verktøy, vil økt antall DFT komponenter og anslag øke presisjon og pålitelighet av resultatene, mens de ikke merkbart hindrer databehandlingsytelse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Benjamin Krause for fruktbar diskusjon og hans støtte. Forfatterne videre Takk Robert Günther for hans hjelp med levende celle mikroskopi.
Arbeidet ble støttet av DFG økonomisk støtte NI1167/3-1 (JIMI) til R.N. og Z.C., DFG økonomisk støtte CRC 1278 PolyTarget prosjektet Z01 for Z.C., C01 i TRR130 R.N. og SFB633, TRR130, Exc257 A.E.H. og J.B.S. BfR gitt intramural støtte SFP1322-642 for F.L.K og Al
Imaris 9.1.2, software | Bitplane, Zürich, Switzerland | v.9.1.2 | 3D image reconstruction and surface generation; this was used by us! |
Blender 2.75a, software | https://www.blender.org/ | v.2.75a | 3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python |
Fiji /ImageJ, software | https://fiji.sc/ | ImageJ v.1.52b | Open source multi-D image analysis toolkit |
MATLAB | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | General computational mathematical software |
MATLAB Machine Learning kit | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | Can only be used together with MATLAB |
Fiji plugins: SHADE | https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis | v.1.0 | |
Fiji plugins: ActiveContour | http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start | absnake2 | |
Computer | Any | NA | See Imaris instructions for minimum computer requirements |