In Vitro Metod för att kontrollera koncentrationerna av halogenerade gaser i odlade alveolära epitelceller
Summary
Vi beskriver ett enkelt protokoll som särskilt utformade för att nå exakt och kontrollerad koncentrationer av sevofluran eller isofluran i vitro för att förbättra förståelsen av mekanismer som är involverade i den epitelial lungskada och testa roman terapier för akut respiratoriskt distressyndrom.
Abstract
Akut andnödssyndrom (ARDS) är ett syndrom av diffusa alveolära skada med nedsatt alveolär vätska clearance och svår inflammation. Användningen av halogenerade ämnen, såsom sevofluran eller isofluran, för sedering på intensivvårdsavdelning (IVA) patienter kan förbättra gasutbyte, minska alveolära ödem och dämpa inflammation under ARDS. Dock saknas data från användning av inhalerade medel för kontinuerlig sedering på IVA att behandla eller förebygga lungskador. För att studera effekterna av halogenerade agenter på alveolära epitelceller ”fysiologiska” villkor, vi beskriva ett enkelt system att odla celler på gränssnittet luft-vätska och utsätta dem för halogenerade ombud att ge exakt kontrollerad ”air” fraktioner och ”medium” koncentrationer för dessa agenter. Vi utvecklade en förseglad lufttät kammare där plattor med mänskliga alveolära epitelceller till förevigade kan utsättas för en exakt, kontrollerad bråkdel av sevofluran eller isofluran använder en kontinuerlig gasflödet som tillhandahålls av en narkos maskin krets. Celler exponerades för 4% av sevofluran och 1% av isofluran i 24 timmar. Gas masspektrometri utfördes för att bestämma koncentrationen av halogenerade agenter upplöst i mediet. Efter först var timme, koncentrationerna av sevofluran och isofluran i mediet 251 mg/L respektive 25 mg/L. Kurvor som representerar koncentrationerna av både sevofluran och isofluran upplöst i det medium som visade liknande kurser över tid, med en platå som nås på en timme efter exponeringen.
Detta protokoll utformades för att nå exakt och kontrollerad koncentrationer av sevofluran eller isofluran i vitro att förbättra förståelsen av mekanismer som är involverade i epitelial lungskada under ARDS och testa nya terapier för den syndrom.
Introduction
Akut andnödssyndrom (ARDS) är ett kliniskt syndrom som kännetecknas av diffusa alveolära skada, lung ödem och hypoxemisk andningssvikt. Även om ARDS utgör mer än 10% av intensivvårdsavdelningen (IVA) antagning och nästan 25% av ICU patienter som kräver mekanisk ventilation, är det fortfarande en under erkända utmaning för kliniker, med en dödlighet på sjukhus av 35-45%1. Trots intensiv forskning, har identifiering av en effektiv ARDS farmakologisk behandling eller förebyggande misslyckats hittills. Två stora funktioner bidrar till dödlighet i ARDS: nedsatt alveolär vätska clearance (AFC) (dvs. förändrad resorption av alveolära ödem vätska från distala lung luftrum) och svår inflammation2. Eftersom ARDS dödlighet förblir hög, bör nuvarande initiativ även omfatta primärprevention; en viktig utmaning är dock att identifiera at-risk patienter i vilken ARDS är benägna att utveckla och vem gynnas om ARDS hindrades.
Flyktiga halogenerade anestetika, såsom sevofluran och isofluran, används ofta för att tillhandahålla generell anestesi i operationssalen. Hela världen, mer än 230 miljoner patienter som genomgår större operationer varje år kräver narkos och mekanisk ventilation3och postoperativa lungkomplikationer påverka negativt kliniska resultat och hälso-och utnyttjande4 . Användning av sevofluran i stället för propofol förknippades med förbättrad lunginflammation hos patienter som genomgår thoraxkirurgi och betydande minskning av negativa händelser, såsom ARDS och postoperativa lungkomplikationer5. Likaså hade förbehandling med isofluran skyddande effekter på luftvägarna mekanik, syresättning och hemodynamik i experimentella djurmodeller av ARDS6,7. Även om ytterligare studier är berättigade för att hantera effekterna av inhalerade medel på resultat i noncardiac kirurgi, en liknande minskning av lungkomplikationer nyligen har observerats i en meta-analys, visar att inandning bedövningsmedel — som motsats till intravenös anestesi — är signifikant associerade med en minskning i dödlighet för hjärtkirurgi8.
Det saknas specifika prospektiva data om användning av flyktiga agenter för sedering av ICU patienter för att förebygga eller behandla lungskador. Men flera studier har nu stöd effekt och säkerhet av inhaleras sevofluran för sedering av ICU patienter och prekliniska studier har visat att inhaleras sevofluran och isofluran7,9 förbättra gasutbyte, minska alveolära ödem och dämpar inflammation i experimentella modeller av ARDS. Sevofluran mildrar dessutom typ II epitelial cell skada10, medan isofluran upprätthåller integriteten för den alveolära-kapillär barriären genom modulering av åtsittande föreningspunkt protein11. Dock behövs ytterligare studier för att kontrollera i vilken utsträckning den experimentella bevisen av orgel skydd från inhaleras sevofluran och isofluran kunde översättas till människor. En första singel-center randomiserad kontrollerad-studie (RCT) från vår grupp fann att tidig användning av inhalerade sevofluran hos patienter med ARDS var associerat med förbättrad syresättning, reducerade nivåer av vissa pro-inflammatoriska markörer och nedsatt lung epitelial skador, enligt bedömning av nivåerna av löslig form av receptorn för avancerad glykation end-produkter (sRAGE) i plasma och alveolär vätska12.
Sammantaget kunde de positiva effekterna av sevofluran och isofluran på lungskada peka på flera biologiska spridningsvägar eller funktionella processer som är beroende av RASERI vägen, nämligen alveolär vätska clearance (AFC), epitelial skador, flyttning av nuclear factor (NF)-κB, och makrofag aktivering. Sevofluran kan dessutom påverka uttrycket av RAGE protein själv. Eftersom tidigare forskning av vår forskargrupp och andra stöder avgörande roller för RAGE alveolär inflammation och lung epitelial skador och reparera under ARDS, utformade vi en experimentell modell att tillhandahålla en translationell förståelse av mekanismer sevofluran i lungorna skada och reparation13,14,15. In vitro- effekterna av sevofluran och isofluran undersöktes i en roman mänsklig alveolära epitelceller primär cell linje särskilt utformade för att studera luft-blod-barriären av perifera lungan, hAELVi (mänskliga Alveolar Epithelial LentiVirus förevigat), med alveolära typ jag-liknande egenskaper inklusive funktionella åtsittande föreningspunkter16.
Medan du förbereder utformningen av våra in vitro- undersökningar (t.ex. kulturer av alveolära epitelceller vid luft-vätska gränssnitt med exponering för ”inhalerade” sevofluran eller isofluran, vi förstått från tidigare publicerats studier som fraktioner av sevofluran har endast utvärderats i ”luften” gränssnitt17,18,19 använder standard övervakare (liknande dem som används i en klinisk miljö). Halogenerade agent koncentrationer valdes oftast enligt de minsta alveolära koncentrationen (MAC) värdena (t.ex. i människor, för sevofluran, 0,5 och 1,1 2,2 Vol.%, vilket motsvarar 0,25, 0,5 och 1 MAC, respektive, för isofluran, 0,6, 0,8, och 1.3 Vol.% vilket motsvarar 0,25, 0,5 och 1 MAC, respektive)20. Sevofluran och isofluran koncentrationer har faktiskt aldrig undersökts i odlingsmediet själv, vilket begränsar giltigheten av tidigare experimentella modeller och instrument. Dessutom används de flesta experiment en anaerob burk som var förseglad efter den luft blandning innehållande sevofluran hade rensats inuti. Som vårt mål var att studera alveolära epitelceller ”fysiologiska” villkor, trodde vi att sådana anaeroba tillståndet inte kan vara optimal och skulle inte vara förenligt med länge experimentell varaktigheter. Därför vi utvecklat våra egna system för att odla celler på gränssnittet luft-vätska och utsätta dem för halogenerade ombud (sevofluran och isofluran) med syfte att ge exakt kontrollerad ”air” bråk och ”medium” koncentrationer för dessa agenter. Vi anser är detta experimentella steg, som inte har rapporterats hittills i litteraturen, obligatoriskt innan eventuella ytterligare in vitro- undersökningar av sevofluran och isofluran.
Protocol
Representative Results
Discussion
Våra protokollet beskriver en enkel metod för att exponera celler till en exakt bråkdel av en halogenerade bedövningsmedel, såsom sevofluran eller isofluran. Dessutom redovisar vi här – för första gången — ett strikt samband mellan både andelen gas och koncentrationen av sevofluran och isofluran inuti odlingssubstratet själv. Detta grundläggande steg nu tillåter oss att tryggt använda vår lufttät kammare för att studera effekterna av dessa halogenerade agenter i en odlade enskiktslager av mänskliga …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Auvergne regionala rådet (”programmet Nouveau Chercheuren de la Région Auvergne” 2013) och den franska Agence Nationale de la Recherche och den riktning Générale de L’Offre de Soins (”programmet de Recherche Translationnelle sv Santé” ANR-13-PRTS-0010) för bidragen. Finansiärerna hade inget inflytande i studiens utformning, genomförande och analys eller i utarbetandet av denna artikel.
Materials
| Sevoflurane | Baxter | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Isoflurane | Virbac | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Human Alveolar Epithelial cells | InScreenex | INS-CI-1015 | |
| huAEC Medium (ready-to-use) | InScreenex | INS-ME-1013-500ml | |
| Anesthetic machine circuit | Drager | Fabius | |
| Gas analyzer | Drageer | Vamos Plus | |
| Anesthetic gas filter | SedanaMedical | FlurAbsord | |
| Heated Humifier | Fisher&Paykel | MR850 | |
| Chamber | Curver | 00012-416-00 | |
| Gas chromatography coupled with mass detection | Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA | Trace 1310 with TSQ 8000evo | |
| Fused-silica column (30 m x 1.4 µm, 0.25 mm ID) | Restek, Lisses, France | Rxi-624Sil MS |
References
- Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).
- Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
- Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242 (3), 341-343 (2005).
- De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110 (6), 1316-1326 (2009).
- Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41 (8), 415-421 (2015).
- Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
- Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124 (6), 1230-1245 (2016).
- Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
- Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
- Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
- Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. , (2016).
- Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192 (2), 191-199 (2015).
- Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10 (8), e0135857 (2015).
- Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33 (3), 251-260 (2016).
- Yue, T., Roth Z’graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31 (1), 118-125 (2008).
- Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
- Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
- Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91 (2), 170-174 (2003).
- Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878 (1), 45-50 (2010).
- Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26 (6), 756-763 (1965).
- Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3 (Suppl 1), (2015).
- Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (11), L975-L985 (2014).
