Ex Vivo роговицы орган культуры модель для заживления ран исследований
Summary
Протокол для ex vivo роговицы орган культуры модель полезна для заживления ран исследований описано. Эта модель система может использоваться для оценки воздействия агентов для ускорения регенеративных заживления или токсичности препарата в организованной среде 3D многоклеточных.
Abstract
Роговицы широко используется как модель системы для изучения заживление ран. Способность создавать и использовать основной mammalian клеток в двух размеров (2D) и три трехмерные (3D) культуры вызвало большой объем информации не только о роговицы биологии, но и о рану исцеление, Миофибробласт биологии и в целом рубцов . Целью протокола является системой пробирного для количественной оценки развития Миофибробласт, который характеризует рубцов. Мы демонстрируем роговицы орган культуры ex vivo модель с помощью свинья глаза. В этом передней кератэктомия раны с дисковой пилы, называемый трепаном являются ранения роговицы до сих пор в мире. Вилка примерно 1/3 передней роговицы удаляется, включая эпителия, базальной мембраны и передней частью стромы. После ранения, роговицу вырезанные из шара, смонтирован на базе коллагена/агар и культивируемых на две недели в дополнение сыворотка бесплатно средний с стабилизированный витамин C дополнить пролиферации клеток и внеклеточного матрикса секреции от резидентов фибробластов. Активация миофибробласты в передней стромы проявляется в исцелил роговицы. Эта модель может использоваться для анализа закрытия РАН, развитие миофибробласты и фиброзных маркеры и токсикологических исследований. Кроме того последствия малых молекул ингибиторов, а также липидов опосредованной siRNA трансфекции за нокдаун гена может испытываться в этой системе.
Introduction
Рубцов в результате травмы, травмы или инфекции роговицы может привести к изнурительной помутнения и потере постоянного зрения. Таким образом есть острую необходимость определения путей, которые могут быть направлены для терапевтического вмешательства. Текущие параметры лечения ограничены и состоят в основном из операций по пересадке роговицы, которые не являются доступными для пациентов по всему миру. Человека (рис. 1) и животных роговицы может быть использован для 2D и 3D клеточной культуры исследования1,2. Не подходит для пересадки роговицы человека труп можно получить от глаз банков или централизованной тканевых банков (национальных болезни исследования обмена (НДРИ)), и животное глаза могут быть получены из скотобойни. Первичный роговицы эпителиальных клеток, фибробласты стромы и совсем недавно, эндотелиальные клетки, можно изолированные культивированный из этих тканей для заживления ран и токсикология изучает3,4,5. Помимо важности понимания молекулярные основы слепоте глазных болезней доступность ткани и способность к первичной культуре клеток сделал роговицы систему важной моделью для изучения. Роговицы идеально подходит для тестирования влияния агентов на рубцы, как нормальные роговицы является прозрачным и некоторых видов РАН создавать помутнения или фиброзных рубцов (обзор в6). Несколько в vivo роговицы рану исцеления модели широко использовались также для рубцов исследований1. Меньше использовать был ex vivo роговицы раны исцеления модель7,8 , опишите подробно здесь. Цель этого метода заключается в количественном определении рубцов результаты характеризуются фиброзных создателей в 3D многоклеточных роговицы ex vivo модели системы.
Роговицы эпителиальных ранения, которые не нарушают эпителиальных базальной мембраны обычно закрывается в течение 24-72 ч9. Вскоре после ранения, клетки на краю эпителия начать распространение и мигрируют в свободной поверхности эпителия, чтобы восстановить эпителиальные барьерную функцию. Эта деятельность последовательно следуют активации роговицы базально-клеточной пролиферации, первый и, в более поздней стадии, расположенные в зоне внешней послабляющие добиться восстановления эпителиальных клеток массы10,11клеток-предшественников. Часто эти раны заживают без рубцов. Однако рана, которая проникает стромы базальной мембраны часто приводит к шрам формирования1. После ранения роговицы стромы, строма заполняется с ячейками нескольких происхождения, включая дифференцированных резидентов стромальных клеток, а также костный мозг производные фиброциты12,,1314. Фиброзных рубцов характеризуется сохранением миофибробласты в заживления раны. Эти патологические миофибробласты продемонстрировать увеличение адгезии через накопление интегринов в фокуса спайки, сократительная α-гладких мышц актина (α-SMA) стресс волокон и локальная активация внеклеточного матрикса (ECM)-поглощенных латентный преобразование фактор роста бета (TGFβ). Дифференцировки эпителия производные клеток, известный как эпителиального мезенхимальных перехода (EMT), может также способствовать шрам формирования6.
Существует тонкий баланс между дифференцировки клеток и апоптоз после ранения. Из-за нарушения в базальной мембраны, факторы роста, такие, как тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и TGFβ от слез и эпителия купаться стромы, вызывая Миофибробласт дифференциации, устойчивый Аутокринный петля TGFβ активации и секрецию дезорганизованы фиброзных ECM15,16. Сохранением миофибробласты в зарубцевавшиеся раны способствует дымки и рубцов в роговице (рис. 2). Однако, в регенеративным зарубцевавшиеся раны хотя миофибробласты развиваются, они apoptose и таким образом отсутствуют или значительно сокращена в номер в зарубцевавшиеся ткани (обзор в ссылка6,10). Таким образом по крайней мере в части исследования по фиброзных рубцов уделялось ориентации молекул, которые препятствуют чрезмерной Миофибробласт развития или Миофибробласт сохранение17,18. Потому что Миофибробласт сохранение характеризует рубцов и фиброзных болезни всех тканей19, роговицы может быть полезным в качестве модельной системы для изучения общих клеточных механизмов фиброза.
В нашей модели системы с лезвием цилиндрические, называемый трепаном еще в мире ранения роговицы. Человека и свинья роговицы может быть ранен с либо 6 или 7 мм трепанации; для кролика роговицы трепаном 6 мм является предпочтительным. Свинья роговицы аналогичные по размеру человека роговицы. Потому что они являются экономически эффективным и легко доступны в больших количествах, свинья роговицы обычно используются для органной культуры. Кроме того антитела и малые интерферирующие РНК, сделал реагировать с человека последовательно cross-reacted с свинья7. После ранения, роговицы, вырезанные из шара с лимба нетронутыми и смонтирован на базы агар/коллагена. Роговицы культивировали в сыворотке свободных СМИ плюс стабилизированный витамин С для моделирования распространения фибробластов и ECM осаждения20. Добавлением сыворотки ни факторы роста необходимо побудить Миофибробласт формирования7. Роговицы обычно закрепляются и обрабатываются для гистологии после двух недель культуры. Нокдаун гена, или для проверки воздействия агента на заживление ран рану можно лечить с помощью малых интерферирующих РНК в рану после ранения7 или растворимые агента могут быть добавлены к средствам массовой информации, соответственно8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает модель для изучения заживления ран в природных слоистых 3D-среде. Использование органной культуры в качестве посредника между клеточной культуры и в естественных условиях исследования значительно снижает затраты, а также сокращения процедуры на живых животных…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH-неи R01 EY024942, исследования, чтобы предотвратить слепоту, Upstate медицинского университета неограниченный исследовательских фондов, и львы район 20-ю. микроскопия и анализ изображений парафиновых срезах были исполнены на ЯДРЕ микроскопии и Гистологические слайд подготовка была исполнена на Biorepository и основной патологии в школе медицины Icahn на горе Синай.
Materials
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100X |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100X |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100X |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100X |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200X |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera | |
References
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
- Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
- Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
- Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
- Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
- Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
- Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
- Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
- Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
- Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
- Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
- Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
- White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
- Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
- Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
- Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
- Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
- Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
- Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
- Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
- Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
- Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
- Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).
