JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Published: February 15, 2019
doi:
10.3791/58562
, ,
1Department of Ophthalmology,SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology,Columbia University Medical Center

Summary

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Abstract

Kornea kapsamlı bir model sistem olarak yara iyileşmesi çalışma kullanılmaya başlanmıştır. Yeteneği oluşturmak ve iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) kültür birincil memeli hücrelerinde kullanmak sadece kornea biyoloji hakkında aynı zamanda şifa, myofibroblast biyoloji ve genel olarak yara yara hakkında bilgi hazinesi üretti . Protokol amacı skarlasma karakterize myofibroblast geliştirme miktarının bir tahlil sistemidir. Biz domuz gözleri kullanarak bir kornea organ kültür ex vivo modeli göstermek. Yarası bu ön keratectomy içinde kornealar hala dünya içinde bir trephine olarak adlandırılan bir dairesel bıçakla yaralı. Bir fiş yaklaşık 1/3 ön kornea epitel, membran ve stroma ön parçası gibi kaldırılır. Yaralama sonra kornealar dünyanın gelen kesmek, kollajen/agar üste monte ve stabilize hücre çoğalması ve hücre dışı matriks salgılanmasını artırmak için C vitamini ile desteklenmiş serum özgür ortamda iki haftadır ikamet fibroblastlar tarafından kültürlü. Myofibroblasts anterior stroma içinde aktivasyonu iyileşmiş kornea belirgindir. Bu model yara kapatma, myofibroblasts ve fibrotik işaretleri ve toksikoloji çalışmaları için tahlil için kullanılabilir. Buna ek olarak, küçük molekül inhibitörleri yanı sıra lipit-aracılı siRNA transfection gen nakavt için etkileri bu sistemi test edilebilir.

Introduction

Yaralanma, travma ya da enfeksiyon sonucu kornea skarlasma opaklıklar ve kalıcı görme kaybı zayıflatıcı için yol açabilir. Böylece, terapötik müdahale için yönlendirilebilir yolları tanımlamak için kritik bir ihtiyaç vardır. Mevcut tedavi seçenekleri sınırlı ve dünya çapında hastalar için erişilebilir değildir öncelikle kornea nakillerine oluşur. İnsan (Şekil 1) ve hayvan kornealar-ebilmek var olmak kullanmak için 2D ve 3D hücre kültürü çalışmaları1,2. İnsan kadavra kornealar nakil için uygun değildir göz bankaları veya merkezi doku bankaları (Ulusal hastalık araştırma değişim (NDRI)) elde edilebilir ve hayvan gözleri bir mezbaha elde edilebilir. Birincil kornea epitel hücreleri, stromal fibroblastlar ve daha yakın, endotel hücreleri, izole ve olması için yara iyileşmesi bu dokularda gelen kültürlü ve toksikoloji3,4,5çalışmalar. Göz hastalığı kör moleküler temelini anlamak önemi ek olarak, çalışma için bir önemli model sistemi kornea doku ve kültür primer hücre yeteneği erişilebilirliğini yaptı. Korneanın normal kornea şeffaf ve opaklıklar veya fibrotik izleri (6‘ gözden) belirli türden yaralar oluşturmak gibi yara izi üzerinde ajanların etkileri test etmek için idealdir. Birkaç vivo içinde kornea yara iyileşme modelleri Ayrıca kapsamlı çalışmalar1yara izi için kullanılmıştır. Daha az kullanılan eski olmuştur vivo kornea yara burada ayrıntılı olarak açıklayan şifa modeli7,8 . Bu yöntemin skarlasma sonuçları çok hücreli bir 3D fibrotik yapımcıları ile karakterize ölçmek için hedeftir kornea ex vivo modeli sistemi.

Bu epitelyal membran normalde ihlal etmediği yaralama kornea epitel 24-72 h9içinde kapanır. Yakında yaralama sonra hücreleri epitel kenarında yayılan ve ücretsiz epitel yüzeye epitel bariyer fonksiyonu yeniden kurmak için geçiş yapma başlayın. Bu etkinlik ardışık olarak kornea bazal hücre çoğalması etkinleştirme tarafından ilk ve, bir sonraki aşamada, kurtarma epitel hücre kitle10,11ulaşmak için dış limbal bölgede bulunan öncü hücrelerinin içinde gelir. Bu yaralar kez skarlasma olmaksizin iyilesmektedir. Ancak, membran kez stroma nüfuz bir yara yara oluşumu1sonuç. Kornea stromal yaralama sonra stroma farklılaştırılmış ikamet stromal hücreler kemik iliği türevi fibrocytes12,13,14gibi birden çok kökenli hücreleri ile doldurulur. Fibrotik yara iyileştirici bir yara myofibroblasts sebat karakterizedir. Bu patolojik myofibroblasts integrinler odak yapışıklıklar, contractile α-düz kas aktin (α-SMA) stres lifleri ve hücre dışı matriks (ECM) yerel etkinleştirme birikimi ile artan yapışma göstermek-münzevi gizli dönüştürme büyüme faktörü-beta (TGFβ). Epitel mezenkimal geçiş (EMT), bilinen, türetilmiş epitel hücreleri farklılaşma da oluşumu6scar için katkıda bulunabilir.

Yaralama sonra hücre farklılaşma ve Apoptozis arasında hassas bir denge olduğunu. Trombosit-türevi büyüme faktörü (PDGF) ve TGFβ gelen gözyaşları ve epitel myofibroblast farklılaşma, TGFβ harekete geçirmek, sürekli otokrin döngüsünü inducing stroma, banyo yapma gibi membran ihlali nedeniyle, büyüme faktörleri ve salgı dağınık fibrotik ECM15,16. İyileşmiş yara myofibroblasts sebat haze ve kornea (Şekil 2) skarlasma teşvik etmektedir. Ancak, regeneratively iyileşmiş yara myofibroblasts geliştirmek rağmen onlar apoptose ve böylece yok olan veya önemli ölçüde azaltılmış numarası (başvuru6,10dakika sonra gözden) iyileşmiş doku. Böylece, fibrotik skarlasma araştırma en azından kısmen aşırı myofibroblast geliştirme veya myofibroblast sebat17,18önlemek molekülleri hedefleme üzerinde odaklanmıştır. Çünkü tüm dokularda19skarlasma ve fibrotik hastalığında myofibroblast sebat karakterize, kornea fibrozis genel hücresel mekanizmaları incelemek için bir model sistem olarak yararlı olabilir.

Modeli sistemimizde bir trephine hala içinde iken dünya denilen silindirik bir bıçak ile kornea yaralı. İnsan ve domuz kornealar yaralı ya da bir 6 veya 7 mm trephine ile; tavşan kornealar için 6 mm trephine tercih edilir. Domuz kornea insan kornea boyutunda benzer. Uygun maliyetli ve çok sayıda hazır oldukları için domuz kornealar rutin olarak organ kültür için kullanılır. Ayrıca, antikorlar ve insan ile tepki için yapılan çift sürekli olarak domuz7ile cross-reacted. Yaralama sonra kornealar limbus ile dünya üzerinden olduğu gibi kesilir ve bir agar/kollajen üzerinde temel monte. Kornealar serum serbest ortamda kültürlenir Ayrıca fibroblast proliferasyonu ve ECM ifade20benzetimi yapmak için C vitamini stabilize. Ne serum eklenmesi ne de büyüme faktörleri myofibroblast oluşumu7ikna etmek için ihtiyaç vardır. Kornealar düzenli olarak sabit ve histoloji için kültür iki hafta sonra işlenir. Gen nakavt veya yara iyileşmesi üzerinde bir ajan etkilerini test etmek için yara ile siRNA yarada7 yaralama sonra tedavi edilebilir veya çözünür bir ajan medya için sırasıyla8eklenebilir.

Protocol

1. organ kültür Hazırlıklar Agar çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın. Küçük bir şişeye %1 agar ve DMEM-F12 1 mg/mL sığır kolajen hazırlamak ilâ 20 mL. Sıcak plaka üzerinde kaynamaya getir. Çözüm 50 mL konik tüp içine koymak. Tüp güçlendirilerek gelen çözüm tutmak için sıcak tabakta su banyosu yerleştirin. İlave serum-ücretsiz medya (SSFM) göre sağlanan Malzemeler tablokompozisyon hazırlamak.Not: S…

Representative Results

İmmünhistokimya olduğunu kullanılan birincil tahlil eski başarısını çözümlemek için şifa deney vivo yara. Şekil 4 epitel ve denetim doku (Şekil 4A, 4B) ön stroma gösteriyor. Altı saat sonra yaralama, epitel (Şekil 4 c, 4 D) yapıldı. Beklendiği gibi yaralama sonra altı gün epitel (4E rakam, 4F) reg…

Discussion

Bu iletişim kuralı bir doğal tabakalı 3D ortamda yara iyileşmesi eğitim için bir modeli açıklar. Bir ara içinde vivo çalışmalar arasındaki hücre kültürü olarak organ kültür kullanımı yanı sıra canlı hayvanlar üzerinde azalan bakiyeli yönergeleri maliyeti önemli ölçüde azaltır. Diğer 3D modelleri kollajen jelleri birincil insan kornea fibroblastlar2 ya da bu aynı hücrelere yapılan kendi kendine sentezleme dahil olmak üzere alana büyük fayda hayvan kaynaklı co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NIH NEI R01 EY024942, araştırma önlemek körlük, şehir dışında Üniversitesi Tıbbi sınırsız Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir ve aslanlar bölge 20-Y. mikroskobu ve görüntü analizi parafin bölümlerin mikroskobu özünde gerçekleştirilen ve histolojik slayt hazırlama Biorepository ve Sina Dağı, Icahn Tıp Fakültesi Patoloji özünde gerçekleştirildi.

Materials

PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100X
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100X
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100X
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100X
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200X
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Tags

Artificial IntelligenceAI Writing AssistantText GeneratorContent AutomationCopywritingArticle GenerationAutomated Copywriting
check_url/58562?article_type=t&slug=ex-vivo-corneal-organ-culture-model-for-wound-healing-studies

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image