En detaljert protokoll for vurdering av strukturelle og visuelle readouts i gnagere optical coherence tomografi og optokinetic responsen er presentert. Resultatene gi verdifull innsikt for ophthalmologic samt nevrologiske undersøkelser.
Optical coherence tomografi (OCT) er en rask, ikke-invasiv, interferometric teknikk tillater høyoppløselig retinal imaging. Det er et ideelt verktøy for etterforskningen av prosesser neurodegeneration, neuroprotection og Nevro-reparasjon med visuelle systemet, som disse ofte correlate godt med retinal endringer. Som en funksjonell avlesning, visuelt vakte kompenserende eye og bevegelser av hodet brukes ofte i eksperimentelle modeller med funksjonen visuelle. Kombinere begge teknikkene kan en kvantitativ i vivo undersøkelse av struktur og funksjon, hvilke kan brukes å undersøke de pathological betingelsene eller vurdere potensialet i romanen therapeutics. En stor fordel av presentert teknikker er muligheten til å utføre langsgående analyser slik at etterforskningen av dynamisk prosesser, reduserer variasjon og kutter ned antall dyr nødvendig for eksperimenter. Protokollen beskrevet mål å gi en manual for oppkjøp og analyse av høy kvalitet retinal skanninger av mus og rotter bruke lavpris tilpasset innehaver med mulighet for å levere inhalasjon-anestesimiddel anestesi. I tillegg er foreslåtte guiden ment som en Instruksjonsvideo manuell for forskere bruker optokinetic svaret (OKR) analyse i Red, som kan tilpasses til deres behov og interesser.
Undersøkelse av visuelle veien, som en del av det sentrale nervesystemet, har vist seg for å være en effektiv utgangspunkt i møte ikke bare ophthalmologic1,2,3,4,5 , men også nevrologiske6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 spørsmål. De siste årene, OCT og OKR har blitt identifisert som nyttig analytiske, ikke-invasiv verktøy for å vurdere en rekke retinopathies og retinal manifestasjoner i ulike gnager modeller17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT gir rask og høy oppløsning i vivo visualisering av netthinnen morfologi og struktur i mus og rotter, med resultater i god samsvar med histologiske deler av dyr retinae26. OKR utgjør en rask og robust metode for å vurdere kvantitativt visuelle funksjon.
Mange kan OCT samtidig AC confocal skanning laser ophthalmoscopy (cSLO) bildebehandling med ulike bølgelengder, som gir diagnoseinformasjon om retinal patologi, dvs, visualisering av lipofuscin eller endringer av retinal pigment epitel27. Videre er i vivo avbilding av fluorescens merket celler i transgene dyr mulig28,29,30,31,32. Men er anvendelsen av OCT teknologi på gnager modeller fortsatt utfordrende, hovedsakelig på grunn av liten øye størrelsen. Flere kommersielt tilgjengelige enheter krever tilpasninger og ofte en annen størrelse av holderen må bilde dyrene av ulike arter. I tillegg krever dyr narkose for måling.
OKR enheter kan brukes til å vurdere den visuelle funksjonen i gnagere. Dyrene er plassert på en plattform i midten av en faktisk eller virtuelle sylinder vise glidende rist, som dyrene spor med refleksiv hodet og nakken bevegelser. Dette optokinetic svaret er redusert eller eliminert ved reduksjon eller tap av visuell funksjon.
Målet med denne protokollen er å presentere en manual for måling av netthinnen tykkelse ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig OCT-enhet med en tilpasset holder gir pustet. Protokollen illustrerer hvordan å analysere volumet skanner ved hjelp av programvaren som leveres av produsenten. For visuelle testing, er målet å gi instruksjoner om hvordan du bruker et kommersielt tilgjengelig system for å vurdere OKR.
Denne protokollen gir en instruksjon for tykkelsen og undersøkelse av visuelle funksjon i gnagere. Visuelle readouts blir vanligere i translasjonsforskning,18,,26,,38,,39,,40 og kan enkelt overføres til kliniske studier. Betydelig fordel for OCT sammenlignet histologiske undersøkelser i dyreforsøk er at langsgående analyser er mulig at etterforskningen av dynamisk patologisk prosesser, i stor grad reduserer variasjon og antall dyr nødvendig per studie. Videre er i vivo bildebehandling med OCT ikke underlagt fiksering, skjæring eller flekker gjenstander, som kan påvirke lagtykkelse i histologiske undersøkelser.
Men er ortogonale retningen på laserstrålen i alle plan i forhold til netthinnen et kritisk steg til sikre kvaliteten og reproduserbarhet tykkelse verdiene. Det krever litt trening av etterforskeren og er obligatorisk før oppkjøpet OCT skanninger. I tillegg som kommersielle enheter er bygget for menneskelig programmer, er kvaliteten på gnager OCT bilder fortsatt er underlegne sammenlignet med B-skanninger av menneskelige pasienter. I forfatternes erfaring, kan det være vanskelig å skille de ulike indre retinal lag (netthinnen nerve fiber lag, ganglion celle lag og indre plexiform laget) under håndbok rettelsen. Derfor anbefaler vi analysere disse lagene som en sammensatt avlesning (IRL).
Eksperimentell oppsettet gir en mulighet for flyktige anestesi, f.eks pustet isoflurane, som er, i vår erfaring, tryggere og enklere å administrere enn injiserbare anestesi, f.eks ketamin-xylazine41,42 og reduserer risikoen av tidlig oppvåkning av gnagere ved lengre oppkjøp (f.eks når utføre imaging fluorescently merket celleområde). I en innledende studie, ble volum skanner identifisert som protokoller med høyeste holdbarhet og pålitelighet. Inter rater og test retest pålitelighet var utmerket når volumet skanner unntatt den sentrale delen som inneholder fiberoptisk platen ble vurdert med ICC (intra-klassen korrelasjonskoeffisienten) verdier over 0,85 for alle vurderinger.
Måling av optokinetic svaret er basert på ufrivillig optokinetic refleks, som oppstår som svar på et kontinuerlig flytte felt. I Red, i motsetning til andre arter, innebærer bevegelsen ikke bare øyne, men hele hodet, som kan lett bli oppdaget bruker kameraet.
Skille mellom “oppsporer” eller normal opptreden bevegelser av dyrene krever litt trening av etterforskeren og det er viktig å blindet for forsøksgruppen. I tillegg dyr trenger en tilpasning fase for innstillingen eksperimentelle og under langsiktige mål protokoller, dyrene å bli animert gjentatte ganger for å sikre at “ingen oppsporer” er nå OKR terskelen og ikke å redusere oppmerksomhet. Det er også en betydelig belastning variasjon om funksjonen visuelle laboratoriet mus og rotter43,44. Synsskarphet av gnagere bør derfor vurderes før de er testet og noen belastninger, SJL mus, kanskje ikke engang være egnet for OKR mål, som de er homozygous for allelet Pde6brd1 (retinal degenerasjon 1).
I sammendraget, undersøkelse av netthinnen morfologi og visuelle funksjon i dyremodeller gir ikke-invasiv, langsgående undersøkelser av strukturelle og funksjonelle skader som oppstår i forbindelse med EAE og kan være nyttig i andre modeller som involverer visuelle systemet, inkludert men ikke begrenset til modeller av retinopathies eller synsnerven skade.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd av Dr. Robert filtermedia-stiftelsen og Ilselore Luckow-stiftelsen, samt Biogen og Novartis til PA. Figur 1B ble gjengitt fra “hele kroppen posisjonelle manipulators ved okulær avbildning av anaesthetized mus og rotter: en gjør det selv guide. Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, H., Aktas, O., Brandt, A. U., Hartung, HP., Green, A., Albrecht, P. BMJ åpne Oftalmologi. 1 (1), e000008, 2017” med tillatelse fra BMJ Publishing Group Ltd.
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.10.0 |
blue 25D non-contact lens | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | lens for rodent mesurement |
OptoMotry | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | system for visual function analysis |
OptoMorty HD software | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | Version 2.1.0 |
Inhalation Anesthetic Isoflurane | Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA | 803250 | inhalation anesthetic |
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% | University Hospital Düsseldorf, Germany | N/A | pupillary dilation |
Visc-Ophtal | Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany | 58407 | ophthalmologic eye gel |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software, Version 5.00 |
IBM SPSS Statistics | IBM Corporation, Armonk, New York, USA | N/A | statistical analysis software, Version 20 |