Un protocollo dettagliato per la valutazione delle letture strutturali e visivi in roditori dalla risposta di tomografia e optokinetic ottica di coerenza è presentato. I risultati forniscono informazioni preziose per la ricerca oftalmologica, nonché neurologica.
Tomografia a coerenza ottica (OCT) è una tecnica veloce, non invasivo, interferometrica permettendo di imaging ad alta risoluzione della retina. È uno strumento ideale per lo studio dei processi di neurodegenerazione, neuroprotezione e neuro-riparazione che coinvolgono il sistema visivo, come questi spesso correlano bene con cambiamenti retinici. Come una lettura funzionale, visivamente evocato occhio compensativo e movimenti della testa sono comunemente usati nei modelli sperimentali che coinvolgono la funzione visiva. La combinazione di entrambe le tecniche consente un’indagine quantitativa in vivo della struttura e funzione, che può essere utilizzato per indagare le condizioni patologiche o per valutare il potenziale di nuove terapie. Un grande vantaggio delle tecniche proposte è la possibilità di eseguire analisi longitudinale che consente lo studio dei processi dinamici, riduzione della variabilità e riduce il numero di animali necessari per gli esperimenti. Il protocollo descritto mira a fornire un manuale per acquisizione e analisi di scansioni di alta qualità della retina di topi e ratti utilizzando un supporto personalizzato basso costo con un’opzione per fornire anestesia inalatoria. Inoltre, la guida proposta è da intendersi come un manuale di istruzioni per i ricercatori che usando analisi di risposta (OKR) optocinetico nei roditori, che possono essere adattati ai loro specifici bisogni e interessi.
L’esame della via visiva, come parte del sistema nervoso centrale, ha dimostrato di essere un efficace punto di partenza nell’affrontare non solo oftalmologici1,2,3,4,5 , ma anche neurologico6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 domande. Negli ultimi anni, OCT e OKR sono stati identificati come utili strumenti analitici, non invasivo per valutare una grande varietà di retinopatie e manifestazioni retiniche in vari modelli del roditore17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT permette veloci e ad alta risoluzione in vivo della morfologia retinica e struttura in topi e ratti, con risultati in buon accordo con le sezioni istologiche delle retine animali26. OKR costituisce un metodo veloce e robusto per valutare quantitativamente la funzione visiva.
Molti dispositivi di OCT consentono simultanea confocale imaging oftalmoscopia (cSLO) in scansione laser con diverse lunghezze d’onda, che fornisce informazioni diagnostiche sulle patologie retiniche, vale a dire, visualizzazione dei depositi di lipofuscin o alterazioni di retinico Pigmento epitelio27. Inoltre, in vivo imaging di fluorescenza etichettati cellule in animali transgenici è possibile28,29,30,31,32. Tuttavia, l’applicazione della tecnologia OCT nei modelli del roditore è ancora difficile, principalmente a causa delle dimensioni di piccolo occhio. Dispositivi disponibili in commercio diversi richiedono adattamenti e spesso per gli animali di specie diverse di immagine è necessaria una dimensione diversa del titolare. Inoltre, gli animali richiedono anestesia per la misurazione.
OKR dispositivi possono essere utilizzati per valutare la funzione visiva nei roditori. Gli animali sono posti su una piattaforma al centro di una bombola di reale o virtuale visualizzati da un movimento grati, che traccia gli animali con testa riflessivo e movimenti del collo. Questa risposta optokinetic è ridotto o eliminata in caso di riduzione o perdita della funzione visiva.
L’obiettivo di questo protocollo è di presentare un manuale per la misurazione dello spessore retinico utilizza un dispositivo di OCT disponibile in commercio con un supporto personalizzato fornendo anestesia inhalant. Il protocollo di seguito viene illustrato come analizzare volume scansioni utilizzando il software fornito dal produttore. Per testing visivo, l’obiettivo è di fornire istruzioni su come utilizzare un sistema disponibile in commercio per valutare l’OKR.
Questo protocollo fornisce un’istruzione per le misurazioni di spessore e l’esame della funzione visiva nei roditori. Visual letture sono sempre più utilizzate nella ricerca traslazionale18,26,38,39,40 e sono facilmente trasferibili ai test clinici. Il vantaggio significativo di OCT rispetto alle indagini istologiche negli esperimenti sugli animali è che analisi longitudinale sono possibili permettendo l’indagine dei processi patologici dinamici, in gran parte riducendo la variabilità e il numero di animali necessari per studio. Inoltre, imaging in vivo con OCT non è soggetto a fissazione, taglio o manufatti, che possono interessare lo spessore dello strato in indagini istologiche di colorazione.
Tuttavia, l’orientamento ortogonale del fascio laser in tutti i piani in relazione alla retina è un passaggio fondamentale per garantire la qualità e la riproducibilità dei valori di spessore. Si richiede un certo allenamento dello sperimentatore ed è obbligatoria prima dell’acquisizione di scansioni OCT. Inoltre, come i dispositivi commerciali sono costruiti per applicazioni sull’uomo, la qualità delle immagini OCT roditore è ancora inferiore rispetto a B-Scan dei pazienti umani. Nell’esperienza degli autori, può essere difficile distinguere retinico interno diverso strati (strato delle fibre nervose retiniche, strato delle cellule del ganglio e strato plessiforme interno) durante la correzione manuale. Si consiglia pertanto di analizzare questi strati come una lettura composta (IRL).
La messa a punto sperimentale fornisce un’opzione per anestesia volatile, ad esempio, sostanze inalante isoflurano, che è, nella nostra esperienza, più sicuro e più facile da controllare rispetto l’anestesia iniettabile, per esempio, ketamina-xilazina41,42 e riduce il rischio del risveglio prematuro dei roditori in caso di acquisizione più volte (ad esempio, quando si esegue imaging delle cellule fluorescente etichettate). In uno studio preliminare, volume scansioni sono stati identificati come i protocolli con la più alta validità e affidabilità. L’affidabilità inter-rater e test di ripetizione della prova era eccellente quando volume scansioni escluse la parte centrale contenente il disco ottico sono stati valutati con ICC (coefficiente di correlazione intra-classe) valori superiori 0.85 per tutte le valutazioni.
La misurazione della risposta optokinetic si basa sul riflesso optocinetico involontario, che si verifica in risposta a un campo in continuo movimento. Nei roditori, a differenza delle altre specie, il movimento coinvolge non solo gli occhi, ma tutta la testa, che possa essere facilmente individuata utilizzando la fotocamera.
Distinzione tra “rilevamento” o normali movimenti comportamentali degli animali richiede un certo allenamento dello sperimentatore ed è importante essere accecato per il gruppo sperimentale. Inoltre, gli animali hanno bisogno di una fase di adattamento per ospitare l’impostazione sperimentale e durante protocolli di misura da sempre, gli animali devono essere animato ripetutamente per assicurare che “no tracking” è a causa di raggiungere la soglia OKR e non alla riduzione attenzione. C’è anche una variabilità di sforzo significativo per quanto riguarda la funzione visiva di laboratorio topi e ratti43,44. L’acuità visiva del roditore pertanto dovrebbero essere valutato prima che essi sono testati e alcuni ceppi, come topi SJL, potrebbero anche non essere adatti per misurazioni OKR, quanto sono omozigoti per l’allele Pde6brd1 (degenerazione retinica 1).
In sintesi, l’esame della morfologia retinica e della funzione visiva nei modelli animali permette per indagini non invasive, longitudinale di danni strutturali e funzionali che si verificano nel contesto di EAE e può essere utile in altri modelli che coinvolgono il visual sistema, incluso ma non limitato ai modelli di retinopatie o lesioni del nervo ottico.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio del Dr. Robert Pfleger-Fondazione e Ilselore Luckow-Foundation, nonché Biogen e Novartis a PA. Figura 1B è stato riprodotto da “manipolatori posizionale Whole-body per l’imaging oculare di ratti e topi anestetizzati: una guida fai da te. Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, H., Aktas, O., Brandt, A. U., Hartung, HP., Green, A., Albrecht, P. BMJ Open Oftalmologia. 1 (1), e000008, 2017” con il permesso dal BMJ Publishing Group Ltd.
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.10.0 |
blue 25D non-contact lens | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | lens for rodent mesurement |
OptoMotry | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | system for visual function analysis |
OptoMorty HD software | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | Version 2.1.0 |
Inhalation Anesthetic Isoflurane | Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA | 803250 | inhalation anesthetic |
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% | University Hospital Düsseldorf, Germany | N/A | pupillary dilation |
Visc-Ophtal | Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany | 58407 | ophthalmologic eye gel |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software, Version 5.00 |
IBM SPSS Statistics | IBM Corporation, Armonk, New York, USA | N/A | statistical analysis software, Version 20 |