Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração

Summary

Nós apresentamos um fluxo de trabalho de engenharia do genoma para a geração de novos modelos in vitro para a infecção de HIV-1 que recapitular integração proviral em locais seleccionados genômicas. Segmentação dos repórteres HIV-derivado é facilitada pela manipulação de genoma CRISPR-Cas9-mediada, site-specific. Protocolos detalhados para geração de clone de célula única, triagem e verificação de direcionamento correta são fornecidos.

Abstract

Vírus de imunodeficiência humana (HIV) integra o DNA proviral não aleatoriamente no genoma da célula de acolhimento em sites recorrentes e genômicas hotspots. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a geração de novos modelos in vitro para a infecção pelo HIV com sites de integração genômica escolhido usando tecnologia de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma. Com este método, uma sequência de repórter de escolha pode ser integrada em um locus genômico escolhido, alvo, refletindo sites integração clinicamente relevantes.

No protocolo, o design de um repórter de HIV-derivado e escolhendo de uma sequência de site e gRNA de destino são descritos. Um vetor de direcionamento com braços de homologia é construído e transfectado em células Jurkat T. A sequência de repórter é direcionada para o site selecionado genômico por recombinação homóloga, facilitada por uma quebra de dobro-costa Cas9-mediada no local de destino. Clones de célula única são gerados e examinados para segmentação de eventos por citometria de fluxo e PCR. Os clones selecionados são então expandidos, e direcionamento correto é verificado pela PCR, sequenciamento e mancha do Sul. Eventos fora do alvo potencial de engenharia CRISPR-Cas9-mediada do genoma são analisados.

Usando este protocolo, sistemas de cultura de células de novela essa infecção de HIV modelo em sites de integração clinicamente relevantes pode ser gerada. Embora a geração de clones de célula única e verificação de integração de sequência correto repórter são demorados, as linhas clonais resultantes são ferramentas poderosas para analisar funcionalmente a escolha do local de integração proviral.

Introduction

Integração do DNA proviral no genoma hospedeiro após infecção é um passo crítico no ciclo de vida do vírus de imunodeficiência humana (HIV). Após a integração, o HIV persiste, estabelecendo a latência em subconjuntos de células T CD4 + long-lived tais como as células T CD4 + de memória. Integração do HIV parece ser não-aleatória^1,2. Um número de hotspots genômicas com DNA proviral recorrentemente integrado foi detectado em vários estudos através do sequenciamento de sites de integração em indivíduos infectados agudamente e cronicamente^{2,3,4 ,5,6,7,8}. Curiosamente, em alguns destes sites de integração, o mesmo locus foi detectado em uma grande fração de células infectadas, levando à ideia de que integração em locais recorrentes pode afetar positivamente a expansão clonal¹.

Para avançar a nossa compreensão da importância de sites de integração recorrentes, escolha de local de integração proviral deve ser explorada. No entanto, vários aspectos técnicos dificultam a integração de HIV estuda site escolha e as consequências. Amplamente utilizados modelos de cultura celular de latência do HIV, como linhas de célula JLat não refletem integração recorrentes clinicamente relevantes sites⁹. Estudos em células derivado de paciente primários, por um lado, permitem a descrição da paisagem local de integração de sequenciação mas não permitem análises funcionais. A nosso conhecimento, nenhum modelo experimental adequado está disponível para analisar funcionalmente sites selecionados de integração clinicamente relevantes.

Aqui nós apresentamos um fluxo de trabalho detalhado para gerar novos modelos para a infecção pelo HIV, utilizando tecnologia de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma. O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para gerar linhas de células de repórter derivado de células T que modelam a infecção pelo HIV, carregando um repórter proviral integrado genomically em um site de integração escolhido. Assim, estão servindo como novas ferramentas para explorar como o site de integração proviral pode afetar a biologia do HIV, e como o pró-vírus responde às estratégias de tratamento diferentes (por exemplo,, inducibility por agentes de inversão de latência). Nosso método usa as vantagens de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma, no qual a integração do repórter sequência por recombinação homóloga é facilitada por uma quebra Cas9 induzida por nuclease dobro-costa no local de destino. Sites de destino para a integração são escolhidos de acordo com a proximidade aos locais descritos integração recorrentes de estudos em indivíduos infectados pelo HIV e a presença de motivos de PAM apropriados para engenharia de genoma Cas9-mediada.

Em nossos resultados exemplares, enfocamos o locus de gene BACH2, quais códigos para o regulador transcricional BTB e homologia de CNC 2. Em indivíduos cronicamente infectadas com o HIV em terapia anti-retroviral, BACH2 é um dos loci mostrando o enriquecimento de integrado HIV-1 sequências^3,6,7,8,10. Nós escolhemos um repórter HIV-derivado mínimo consistindo de HIV-1-derivado longo terminal repetição (LTR), a sequência de código tdTomato e hormônio de crescimento bovino (BGH) sinal de poliadenilação (PA), que podemos ter como alvo a dois locais específicos em BACH2 intron 5. O protocolo apresentado é otimizado para células Jurkat, uma humana CD4 + linha celular suspensão derivado de células T, mas outras células linhas podem ser utilizadas e o protocolo adaptado em conformidade. Apresentamos um fluxo de trabalho detalhado para a seleção do local de destino, a construção do vetor de alvo com braços de homologia, CRISPR Cas9-mediada por direcionamento do repórter no local escolhido genômico, geração e seleção de linhas clonais e abrangentes verificação linha de celular do repórter recém-gerado, alvo.

Protocol

1. estratégia de segmentação para genoma engenharia e direcionamento de desenho vetorial (tv) Nota: O primeiro passo da engenharia do genoma envolve a seleção e geração das ferramentas necessárias para CRISPR Cas9-mediada por segmentação. Selecção de um locus de sítio de integração genômica, escolha do tipo de célula para o direcionamento e design de um repórter de HIV-derivado para integração devem preceder esta etapa. Este protocolo descreve como alvo de um…

Representative Results

Neste experimento representativos, optámos por um repórter de HIV-1-derivado mínimo consistindo de um LTR, sequência tdTomato-codificação e sequência de polyA-sinal para dois loci no intron 5 do gene BACH217-alvo. Os Locus para o direcionamento foram escolhidos de acordo com a proximidade de sites publicados integração recorrentes encontrados em diferentes estudos primários células T de pacientes infectados pelo HIV2,<s…

Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar modelos de HIV-1-derivado Jurkat repórter com sites de integração proviral escolhido aplicando engenharia CRISPR-Cas9-baseado do genoma.

Vários pontos do protocolo requerem atenção cuidadosa durante a fase de planejamento. Primeiro, o locus ser alvo deve ser escolhido com cuidado, como alguns loci pode ser mais fácil para o alvo do que outros (por exemplo,, dependendo do estado da cromatina da região e o destino de sequências em si). …

Materials

pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	vector for expression of SpCas9 and gRNA
pMK	GeneArt		mammalian expression vector for cloning
cDNA3.1	Invitrogen	V79020	mammalian expression vector for cloning
BbsI	New England Biolabs	R0539S	restriction enzyme
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5520S	Assembly cloning kit used for target vector generation
TaqPlus Precision PCR System	Agilent Technologies	600210	DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)
96-well tissue culture plate (round-bottom)	TPP	92097	tissue culture plates for dilution plating
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530 L	DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	dimethyl sulfoxide as PCR additive
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution	New England Biolabs	B9021S	MgCl2 solution as PCR additive
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S	dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit	Qiagen	51106	DNA isolation and purification kit
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106	PCR Purification Kit
RPMI 1640 without glutamine	Lonza	BE12-167F	cell culture medium
Fetal Bovine Serum South Africa Charge	PAN Biotech	P123002	cell culture medium supplement
L-glutamine	Biochrom	K 0282	cell culture medium supplement
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml	Biochrom	A 2212	cell culture medium supplement
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media	Thermo Fisher Scientific	31985062	cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection
TransIT-Jurkat	Mirus Bio	MIR2125	transfection reagent
phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	cell culture reagent
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	cell culture reagent
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm	Millex	SLGP033RB	filter unit for sterile filtration
Heracell 150i incubator	Thermo Fisher Scientific	51026280	tissue culture incubator
Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	UV crosslinker
High Prime	Roche	11585592001	kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08	chromatography spin-columns for purification of labeled DNA