Génie de génome CRISPR dotés de Cas9 pour produire des modèles de Jurkat Reporter pour l’Infection à VIH-1 avec les Sites d’intégration Proviral sélectionnés

Résumé

Nous présentons un flux de travail de génie du génome pour la génération de nouveaux modèles in vitro pour l’infection à VIH-1 qui récapitulent l’intégration provirale dans certains sites génomiques. Ciblage des journalistes dérivé du VIH est facilitée par la manipulation du génome CRISPR Cas9-médiation, in situ. Des protocoles détaillés pour la génération de cellule unique clone, dépistage et vérification de ciblage correcte sont fournis.

Résumé

Virus de l’immunodéficience humaine (VIH) intègre son ADN proviral non aléatoirement dans le génome de cellule hôte sites récurrents et génomiques hotspots. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la génération de nouveaux modèles in vitro d’infection à VIH avec des sites choisis intégration génomique à l’aide des technologies d’ingénierie génomique CRISPR dotés de Cas9. Avec cette méthode, une séquence de journaliste de choix peut être intégrée dans un locus génomique ciblé et choisi, reflétant des sites d’intégration cliniquement pertinente.

Dans le protocole, la conception d’un journaliste dérivé du VIH et en choisissant une séquence cible de site et gRNA sont décrites. Un vecteur de ciblage avec les bras de l’homologie est construit et transfecté dans des cellules T Jurkat. La séquence de journaliste s’adresse au site génomique sélectionné par recombinaison homologue, facilitée par une médiation Cas9 bicaténaires pause sur le site cible. Clones de cellules individuelles sont générées et projetés pour le ciblage des événements par cytométrie en flux et par PCR. Clones sélectionnés sont ensuite développées, et un ciblage correct est vérifiée par PCR, séquençage et de Southern. Événements hors-cible du génie de génome CRISPR Cas9-médiation sont analysés.

En utilisant ce protocole, les systèmes de cultures cellulaires roman cette infection à VIH modèle à sites d’intégration cliniquement pertinente peut être générée. Bien que la génération de clones de cellules individuelles et la vérification de l’intégration de séquence correcte journaliste prend du temps, les lignées clonales qui en résultent sont des outils puissants pour analyser fonctionnellement choix site intégration proviral.

Introduction

Intégration de l’ADN proviral dans le génome de l’hôte à l’infection est une étape essentielle dans le cycle de vie du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Après intégration, VIH persiste en établissant la latence en sous-ensembles de cellules T CD4 + vivaces telles que les cellules T CD4 + mémoire. Intégration du VIH semble être non aléatoire^1,2. On a décelé un certain nombre de hotspots génomiques avec l’ADN proviral intégré de manière récurrente dans plusieurs études à travers le séquençage des sites d’intégration aux personnes infectées de manière aiguë et chronique^2,

Protocole

1. cibler stratégie pour génome d’ingénierie et le ciblage de dessin vectoriel (tv)

Remarque : La première étape de l’ingénierie du génome consiste sélection et génération des outils nécessaires pour cibler les CRISPR Cas9-induite. Sélection d’un locus du site intégration génomique, choix du type de cellule afin de cibler et conception d’un reporter dérivé du VIH pour intégration doivent précéder cette étape. Ce protocole décrit le ciblage d’un journaliste minime du VIH-LTR_tdTomato_BGH-PA dans des cellules Jurkat cible. Un diagramme du flux de travail basés sur CRISPR-Cas9 ciblage, génération, dépistage et vérification des l....

Résultats

Dans cette expérience de représentant, nous avons choisi de cibler un journaliste dérivés du VIH-1 minime consistant en une LTR, séquence codant pour tdTomato et la séquence polyA-signal à deux loci dans l’intron 5 du gène BACH2¹⁷. Les locus pour le ciblage ont été choisis selon la proximité avec les sites publiés intégration récurrente trouvés dans différentes études sur des cellules de T primaires de patients infectés par le VIH^2,

Discussion

Nous décrivons ici un protocole visant à générer des modèles de journaliste Jurkat dérivés du VIH-1 avec des sites d’intégration proviral choisi appliquant le génie du génome CRISPR dotés de Cas9.

Plusieurs points du protocole nécessitent une attention particulière durant la phase de planification. Tout d’abord, le locus d’être la cible doit être choisi avec soin, car certains loci pourrait être plus facile à la cible que d’autres (par exemple, selon l’état de la chromatine de la régi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vecteur d’expression de mammifère pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	pour l’expression de SpCas9 et d’ARNg
pMK	GeneArt		Vecteur d’expression de mammifère pour le clonage
d’ADNc3.1	Invitrogen	V79020	Vecteur d’expression de mammifère pour le clonage
BbsI	New England Biolabs	R0539S	Enzyme de restriction
NEBuilder Hifi DNA Kit de clonage d’assemblage	New England Biolabs	E5520S	Kit de clonage d’assemblage utilisé pour la génération de vecteurs cibles
Système de PCR de précision TaqPlus	Agilent Technologies	600210	ADN polymérase avec activité de relecture utilisée pour l’amplification des bras d’homologie (étape 1.2.2.2), vérification du site d’intégration et de la séquence du rapporteur (étapes 3.3.3 et 3.3.5), génération de la sonde génomique pour le transfert de Southern (étape 3.4.1.5) et analyse des événements hors cible (étape 3.5.4)
Plaque de culture tissulaire à 96 puits (à fond rond)	TPP	92097	pour le placage de dilution Phision
High-Fidelity DNA polymérase	New England Biolabs	M0530 L	ADN polymérase utilisée pour la détection des événements de ciblage (étape 2.4.2) et la génération d’une sonde spécifique au rapporteur pour le transfert de Southern (étape 3.4.1.4)
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	Dimethyl sulfoxyde comme PCR additif
Chlorure de magnésium (MgCl2) Solution	New England Biolabs	B9021S	MgCl2 en tant qu’additif PCR
Désoxynucléotide (dNTP) Solution Mélange	New England Biolabs	N0447S	dNTP avec 10 mM de chaque nt pour les réactions PCR
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	Mélange PCR prêt à l’emploi utilisé pour le dépistage PCR (étape 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit	Qiagen	51106	Kit d’isolement et de purification de l’ADN
QIAquick PCR Kit de purification	Qiagen	28106	Kit de purification PCR
RPMI 1640 sans glutamine	Lonza	BE12-167F	milieu de culture cellulaire
Sérum de veau fœtal Afrique du Sud Charge	PAN Biotech	P123002	milieu
de culture cellulaireL-glutamine	Biochrom	K 0282	milieu de culture cellulaire supplément
Pénicilline/Streptomycine 10.000 U/mL/ 10.000 µ ; g/mL	Supplément de milieu de culture cellulaire	Biochrom	A 2212
Gibco Opti-MEM Milieu sérique réduit	Thermo Fisher Scientific	31985062	milieu de culture cellulaire à concentration sérique réduite optimisé pour la transfection
Réactif de transfection	TransIT-Jurkat	Mirus Bio	MIR2125
phorbol 12-myristate 13-acétate	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	culture cellulaire réactif
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	réactif de culture cellulaire
Unité de filtration à seringue, membrane PES, 0,22 & micro ; m	Millex	SLGP033RB	unité de filtration pour filtration stérile
Incubateur Heracell 150i	Thermo Fisher Scientific	51026280	incubateur de culture tissulaire
Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	membrane en nylon chargée positivement pour transfert d’ADN et d’ARN
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	réticulant UV
High Prime	Roche	11585592001	kit pour le marquage de l’ADN avec du dCTP radioactif à l’aide d’oligonucléotides aléatoires comme amorces
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08	colonnes de chromatographie spin-columns pour la purification de l’ADN marqué

Plaques de culture tissulaire supplément de