En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

Summary

Denne protokollen beskriver en fluorescens svingninger spektroskopi tilnærming for å undersøke interaksjon mellom proteiner formidling celle-celle interaksjoner, dvs proteiner lokalisert i cellen veikryss, direkte i levende celler. Vi gir detaljerte veiledninger på instrumentet kalibrering, datainnsamling og analyse, inkludert rettelser til mulig gjenstanden kilder.

Abstract

En rekke biologiske prosesser innebærer celle-celle interaksjoner, vanligvis formidlet av proteiner som samhandler på grensesnittet mellom nabokommunene cellene. Rundt er bare få analyser dugelig av spesielt sondering slik interaksjon direkte i levende celler. Her presenterer vi en analyse for å måle binding av proteiner uttrykt på overflater av nabokommunene cellene på celle-celle kontakter. Denne analysen består av to trinn: blanding av celler som uttrykker proteiner rundt smeltet forskjellige fluorescerende proteiner, etterfulgt av fluorescens svingninger spektroskopi målinger på celle-celle kontakter ved hjelp av en AC confocal laserskanning mikroskop. Vi viser muligheten for denne analysen i en biologisk relevante kontekst ved å måle samspillet av amyloid forløper som protein 1 (APLP1) over celle-celle veikryss. Vi gir detaljert protokoller på datainnsamling bruker fluorescens-baserte teknikker (skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi, cross-korrelasjon tall og lysstyrke analyse) og nødvendige instrument kalibreringer. Videre, vi diskutere avgjørende skritt i dataanalyse og hvordan å identifisere og korrigere eksterne, falske signal variasjoner, for eksempel på grunn av photobleaching eller celle bevegelse.

Vanligvis presentert analysen gjelder homo – eller heterotypic protein-protein interaksjon på celle-celle kontakter mellom celler av samme eller forskjellige typer og kan implementeres på en kommersiell AC confocal laserskanning mikroskop. En viktig forutsetning er stabiliteten i systemet, som må være tilstrekkelig å undersøke diffusive dynamikken i proteiner rundt over flere minutter.

Introduction

Mange biologiske prosesser oppstå ved celle-celle interaksjoner, f.eks celle-celle adhesjon^1,2,3, celle-celle fusion⁴ og mobilnettet anerkjennelse⁵. Slike hendelser er spesielt viktig i utviklingen av multicellular organismer og for celle-celle kommunikasjon, f.eks under immunreaksjoner. Disse prosessene er vanligvis formidlet av proteiner som er lokalisert på overflaten, dvs. i plasma membranen (PM) til nabokommunene cellene og gjennomgå spesifikke interaksjoner ved celle-celle kontakt som er nøyaktig regulert i rom og tid. I mange tilfeller kan disse interaksjoner er direkte homo- eller heterotypic protein-protein trans interaksjoner, men kan også innebære ioner eller ligander som ekstracellulære linkers¹. Selv om du er av grunnleggende betydning, er det mangel på analyser sondering disse bestemt protein-protein interaksjoner direkte i sine opprinnelige omgivelser av levende celler. Mange metoder krever enten celle avbrudd (f.eks biokjemiske analyser som co-immunoprecipitation⁶), fiksering (f.eks noen super-oppløsning mikroskopi optisk teknikker og elektronmikroskop av celle-celle kontakter⁷), eller er ikke-spesifikk, f.eks aggregering / vedheft søk^8,9. For å overvinne problemet, er fluorescens teknikker gjennomført basert på fluorescens resonans energi overføring (bånd)¹⁰ eller fluorescens complementation¹¹. Men for å oppnå tilstrekkelig små avstander mellom fluorophores, krever disse metodene fluorescerende etiketter på ekstracellulære side av proteiner¹⁰, potensielt forstyrre trans interaksjoner.

Her presenterer vi en alternativ fluorescens-baserte analysen for protein-protein interaksjoner i celle-celle kontakter. Denne tilnærmingen kombinerer fluorescens kryss-korrelasjon tilnærminger (skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi (sFCCS), cross-korrelasjon nummer og lysstyrke (ccN og B)) og blanding av celler som uttrykker en fusion konstruksjon av protein av interesse, f.eks en vedheft reseptor. Undersøkte receptors i de to samspill cellene er merket med to spectrally atskilt fluorescerende proteiner (FPs), fra den intracellulær side (se figur 1A).

De næringsdrivende metodene er basert på den statistiske analysen fluorescens svingninger forårsaket av diffusive bevegelse fluorescerende fusion proteiner gjennom fokal volumet av en AC confocal laserskanning mikroskop. Mer i detalj sonder analysen co spredningen av proteiner interesse både nabolandet PMs på celle-celle kontakter. Hvis proteiner gjennomgå trans interaksjoner, vil disse trans komplekser bære fluorescerende proteiner emitting i begge spectral kanalene, forårsaker korrelert fluorescens svingninger av både emittere. Derimot, hvis ingen binding, vil antall svingninger proteiner i overfor PMs være uavhengig, forårsaker ingen samsvarende svingninger. Oppkjøpet kan utføres på to måter: 1) sFCCS er basert på en linje-formet skanning over celle-celle kontakten og effektivt sonder samhandlinger i et sted i regionen kontakt. Gjennom en timelig analyse av fluorescens svingninger gir sFCCS også dynamics informasjon, dvs. diffusjon koeffisientene av protein komplekser; 2) ccN & B er basert på en pixel-wise analyse av en sekvens av bilder kjøpt til celle-celle kontakt regionene. Den har evnen å undersøke og kart interaksjoner langs hele kontakt regionen (i en fokalplanet), men gir ikke informasjon på dynamics. Begge metodene kan kombineres med en analyse av molekylære lysstyrken, dvs. gjennomsnittlig fluorescens signalet slippes ut i tidsenheten av enkelt spre protein komplekser, og dermed gir anslag over støkiometri av protein komplekser på celle-celle kontakter.

I denne artikkelen gir vi detaljert protokoller for eksempel forberedelse, instrument kalibrering, datainnsamling og analyse å utføre presentert analysen på en kommersiell AC confocal laserskanning mikroskop. Eksperimenter kan utføres på instrument Foton teller eller analoge detektorer og et mål med høy numeriske blenderåpning. Vi videre diskutere avgjørende skritt av protokollen og gi korreksjon ordninger for flere prosesser forårsaker artefactual signal svingninger, f.eks detektor støy, photobleaching eller celle bevegelse. Opprinnelig utviklet for å undersøke interaksjoner mellom tilhenger celler, analysen kan endres for suspensjon celler eller tilpasset modell membran systemer, f.eks gigantiske unilamellar blemmer (GUVs) eller gigantiske plasma membran blemmer (GPMVs), slik at den kvantifisering av interaksjoner i forskjellige lipid miljøer eller i fravær av en organisert cytoskjelett^12,13.

Skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi er en modifisert versjon av fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi¹⁴ og var spesielt beregnet på sonde langsom diffusive dynamikk i lipid membraner¹⁵. Den er basert på en linje skanning oppkjøpet vinkelrett til PM med fluorescerende proteiner av interesse. For å undersøke interaksjoner av to annerledes merket protein arter, utføres oppkjøpet i to spectral kanaler med to laser linjer og to oppdagelsen Vinduer for spectrally atskilt fluorophores. På grunn av treg diffusjon dynamikken i proteiner i PM (D≤ ~ 1 µm2/s), en cross-talk-fri måling kan utføres av vekslende eksitasjon ordningen fra linje til linje¹⁵. Analysen starter med: 1) en justering algoritme korrigere for sideveis celle bevegelse basert på block-wise gjennomsnitt ~ 1000 linjer, 2) fastsettelse av posisjon med maksimal fluorescens signaldvs. PM posisjon, i hver blokk og 3) skiftende Alle blokkene til en felles opprinnelse^12,15, separat i hver enkelt kanal. Deretter utføres en automatisk valg av bildepunkter som tilsvarer PM ved å velge den sentrale regionen et Gaussian anfall av summen av alle justerte linjer (dvs. center ± 2.5σ). Integrering av signalet i hver linje gir membran fluorescens tiden serien f (t) i hver enkelt kanal (g = grønn kanal, r = rød sone). Merk at pikselstørrelsen må være små nok, f.eks < 200 nm, å rekonstruere form av punkt spredning funksjon og finne midten, tilsvarer plasseringen av PM. I nærvær av betydelig photobleaching, fluorescens tiden serien i hver kanal kan være modellert med en dobbel-eksponentiell funksjon og deretter korrigert med følgende formel:¹⁶

.    (1)

Det er viktig å merke seg at denne formelen effektivt korrigerer både amplitudes og diffusion times fra korrelasjon analyse av f (t)^c, sammenlignet med parameteren anslår at skulle hentes fra det ukorrigert f (t). Deretter auto – og kryss-korrelasjon funksjonene (ACFs / CCFs) av fluorescensen signaler beregnes:

, (2).

, (3).

hvor sesF_jeg = F_jeg(t) – F_jeg(t) og jeg = g, r.

En todimensjonal diffusjon modell er da utstyrt til alle korrelasjon funksjoner (CFs):

.   (4)

Her, angir N antall fluorescerende proteiner i observasjon volumet og τ_d diffusjon tiden for hver kanal. Denne modellen tar hensyn at beskrevet eksperimentelle innstillingen, spredning av proteiner i PM oppstår i x-z flyet, i motsetning til vanlige konfigurasjonen fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS) eksperimenter på membraner undersøkelser diffusjon i x-y flyet AC confocal volum¹⁷. Livet w₀ og struktur faktoren S, som beskriver forlengelse w_z fokal volumroten i z, S = w_z/w₀, hentes fra et punkt FCS kalibrering mål med spectrally lignende fargestoffer og optisk innstillingene bruke allerede tilgjengelig for diffusion rthe D_fargestoff:

, (5).

hvor τ_{d, fargestoff} er målt gjennomsnittlig diffusjon tiden av fargestoff molekyler, fra montering en modell for tredimensjonale diffusjon til dataene, tar konto overganger av en brøkdel T alle N molekyler til en trilling stat med en gang konstant τ_τ:

.   (6)

Til slutt, diffusjon koeffisientene (D), molekylær lysstyrkeverdier (ε) og relativ kryss-korrelasjonen sFCCS data (rel.cc.) er beregnet som følger:

, (7).

, (8).

, (9).

hvor G_cross(0) er amplituden til funksjonen kryss-korrelasjon og er amplituden til funksjonen autokorrelasjon i jeg-th kanalen.

Denne definisjonen av relativ kryss-korrelasjon, dvs med max i stedet for betyr i ligningen 9, tar hensyn til at maksimalt antall komplekser av to protein arter til stede i ulike konsentrasjoner er begrenset av den arter til stede i et lavere tall.

Cross-korrelasjon tall og lysstyrke er basert på litt analyse av fluorescens intensiteten for hvert bildepunkt i en bildestakk kjøpt over tid til en fast stilling i utvalget, vanligvis bestående av ~ 100-200 rammene, med to spectral kanaler () g = grønn kanal, r = rød sone). Fra timelige middelverdien jeg_jeg og varians , den molekylære lysstyrke ε_jeg og nummer n_jeg beregnes i hver piksel og spectral kanal (jeg = g, r)¹⁸:

, (10).

. (11)

Det er viktig å merke seg at gitt ligningene gjelder det ideelle tilfellet av en sann Foton-telling detektor. For analoge oppdagingssystemer gjelder følgende ligningene^19,20:

, (12).

.   (13)

Her, S er omregningsfaktoren mellom oppdaget fotoner og innspilte digitalt teller, er avlesning støy og forskyvning refererer til detektor intensitet forskyvningen. Vanligvis bør disse antallene kalibreres, for alle merker, basert på måling detektor avviket som en funksjon av intensitet for jevn belysning¹⁹, f.eks en reflekterende metalloverflate eller tørket fargestoff løsning. Forskyvning kan bestemmes ved å måle antall prisen for et utvalg uten eksitasjon lys. Ved å utføre en lineær regresjon av detektor-assosiert variansen versus intensitet (jeg) plot, S og kan være bestemt¹⁹:

.   (14)

Til slutt, cross-korrelasjon lysstyrken beregnes i hver piksel og defineres generelt som²¹

, (15).

hvor er kryss-variansen .

For å filtrere varige svingninger, utføres alle ccN & B beregninger etter en boxcar filtrering, uavhengig for hver piksel²². Kort, n_jeg, ε_jeg (jeg = g, r) og B_cc beregnes i skyve segmenter av f.eks 8-15 rammer. Verdiene anskaffes kan være så gjennomsnitt for å få den endelige pixel tall og lysstyrke.

Støkiometri analyse
For å beregne støkiometri av protein komplekser på celle-celle kontakter, kan molekylær lysstyrken bli separat analysert i hver spectral kanal for sFCCS eller ccN & B data. I sFCCS hentes en lysstyrkeverdi per måling i hver enkelt kanal. I ccN & B, et lysstyrke histogram for alle bildepunkter ved celle-celle kontakten er innhentet og gjennomsnittlig (eller median) verdien kan brukes som representant lysstyrke for målingen. Ved å utføre den samme analysen på en monomerisk referanse, kan alle lysstyrkeverdier normaliseres for å få direkte gjennomsnittlig oligomeric staten oppdaget protein komplekser. På dette punktet, er det viktig å korrigere for tilstedeværelsen av ikke-fluorescerende FPs som kan resultere i en undervurdering av oligomeric. Dette er vanligvis utføres av måle lysstyrken på en homo-dimeric referanse protein^23,24 med én farge sFCS eller tall og lysstyrke (N & B).

Protocol

1. sample forberedelse: Celle-celle blanding analysen Merk: Følgende protokollen beskriver blande fremgangsmåten for tilhenger celler. Det kan endres for cellene kultivert i suspensjon. Frø et passende antall celler i en 6-vel plate, f.eks 800.000 HEK 293T celler (telt med en Neubauer telling kammer), en dag før transfection. Nummeret kan endres avhengig av tiden mellom såing og transfection og justert for andre celletyper. For å utføre et grunnleggende eksperiment (<…

Representative Results

En første test for protein-protein samhandling analysen, dvs. blanding av celler som uttrykker spectrally distinkte fluorescerende proteiner etterfulgt av sFCCS/ccN & B målinger (figur 1), skal utføres på proteiner som ikke forventes å samhandle på celle-celle kontakten (dvs. en negativ kontroll). Derfor HEK 293T celler uttrykke myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) eller -mCardinal ble blandet og sFCCS ble utført over ce…

Discussion

Den eksperimentelle prosedyren beskrevet her kan etterforskningen av protein-protein trans samhandlinger på celle-celle kontakter, ansette fluorescens svingninger spektroskopi teknikker, nemlig sFCCS og ccN & B. Disse metodene omfatter en statistisk analyse av fluorescens svingninger slippes ut av to spectrally atskilt FPs smeltet sammen til protein(s) rundt på en kontakt med to nabokommunene cellene hver uttrykke en eller andre fusion protein. Tilstedeværelsen av trans komplekser er kvantifisert ved…

Materials

DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110