Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

Summary

Этот протокол описывает флуоресценции колебания спектроскопии-подход на основе для изучения взаимодействия белков, посредничество ячеек взаимодействия, т.е. белки локализованы в ячейке развязок, непосредственно в живых клетках. Мы предоставляем подробные руководящие принципы по калибровке, сбора и анализа данных, включая исправления возможных артефакт источникам.

Abstract

Целый ряд биологических процессов предполагает взаимодействие ячеек, обычно при посредничестве белки, которые взаимодействуют на уровне интерфейса между соседними ячейками. Интерес только несколько анализов способны конкретно зондирующего такого взаимодействия непосредственно в живых клетках. Здесь мы представляем assay измерить связывания белков, выраженных на поверхности соседние клетки, в ячейке контактов. Этот assay состоит из двух этапов: Микширование клеток, выражая протеинов интереса, сливается с различными флуоресцентных белков, следуют флуоресценции колебания спектроскопии измерений в ячейке контактов с помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Мы продемонстрировать возможности этот assay в биологически соответствующий контекст путем измерения взаимодействия белков амилоида прекурсоров как 1 (APLP1) через узлы ячеек. Мы предоставляем подробные протоколы на сбор данных, используя методы, основанные на флуоресцирования (сканирование флуоресцентной спектроскопии кросс корреляции, номер кросс корреляции и анализа яркости) и требуемый инструмент калибровки. Кроме того мы обсуждаем важнейшие шаги в анализ данных и как определить и исправить внешний, ложный сигнал вариации, например, те из-за Фотообесцвечивание или ячейки движения.

В целом представленные применима к любому гомо – или гетеротипичной протеин взаимодействия в ячейке контактов, между ячейками в одной или разных типов и могут быть реализованы на коммерческой конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Важным требованием является стабильность системы, которая должна быть достаточной для зонда диффузионное динамики протеинов интереса в течение нескольких минут.

Introduction

Многие биологические процессы происходят на объектах ячеек взаимодействий, например, ячеек адгезии^1,2,3, слияние ячеек⁴ и клеточных признание⁵. Такие мероприятия особенно важны во время развития многоклеточных организмов и для связи ячеек, например, во время иммунных реакций. Эти процессы обычно опосредовано белки, которые локализованы на поверхности, то есть, на плазматической мембраны (PM) соседних клеток и проходят специфических взаимодействий в контакт ячеек, которые точно регулируется в пространстве и времени. Во многих случаях эти взаимодействия прямого гомо – или гетеротипичной белок белковых взаимодействий транс , но может также включать ионов или лигандов, действуя как внеклеточного линкеры¹. Несмотря на основополагающее значение, отсутствует анализов зондирующего эти конкретные белок белковых взаимодействий непосредственно в родной среде живых клеток. Многие методы либо требуют разрушения клеток (например, биохимических анализов как co иммунопреципитация⁶), фиксация (например, некоторые методы оптической микроскопии суперразрешением и электронной микроскопии ячеек Контакты⁷), или являются неспецифическими, например, агрегации / сцепления assays^8,9. Для преодоления этой проблемы, были выполнены флуоресценции методы, основанные на флуоресценции резонансные энергии передачи (ЛАДА)¹⁰ или флуоресценции дополнения¹¹. Однако чтобы добиться достаточно небольших расстояниях между флуорофоров, эти методы требуют флуоресцентные метки на стороне внеклеточных белков¹⁰, потенциально мешать транс взаимодействий.

Здесь мы представляем альтернативной основе флуоресценции assay для взаимодействий протеин протеина в ячейке контактов. Этот подход сочетает в себе флуоресценции кросс корреляции подходы (сканирование флуоресценции кросс корреляции спектроскопии (sFCCS), кросс корреляции номер и яркость (ccN & B)) и смешивания клеток, выражая конструкцию синтеза белка интерес, например, рецептор адгезии. Исследованы рецепторов в двух взаимодействующих клеток помечены с двумя спектрально разлученных флуоресцентных белков (FPs), от внутриклеточного стороне (см. рис. 1A).

Занятых методы основаны на статистическом анализе флуоресценции колебаний, вызванных диффузионного движения флуоресцентные синтез белков через фокуса тома конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Более подробно, assay зонды совместное распространение протеинов интереса в обеих соседних PMs в ячейке контактов. Если белки проходят транс взаимодействий, эти комплексы транс будет нести флуоресцентных белков в обоих спектральных каналов, вызывая колебания коррелированных флуоресценции обоих излучателей. С другой стороны если привязка не происходит, число колебаний белков сталкивается ПМС будет независимым, вызывая не коррелированные колебания. Приобретение может быть выполнена двумя способами: 1) sFCCS основана на линии образный сканирования через контакт клеток и эффективно зонды взаимодействий в месте, расположенная в регионе контакта. Через временной анализ колебаний флуоресценции sFCCS обеспечивает также динамика информацию, т.е. коэффициенты диффузии белковых комплексов; 2) ccN b & B на основе pixel-wise анализа последовательности изображений, приобретенных в регионах контактных ячеек. Он имеет возможность зонда и карта взаимодействия вдоль всего связаться региона (в одной фокальной плоскости), но не предоставляет информацию о динамике. Оба метода могут быть объединены с анализ молекулярных яркость, т.е. средняя флуоресценции сигнал излучаемый одного диффундирующих белковых комплексов в единицу времени и, таким образом, дают оценки стехиометрии белковых комплексов в Контакты ячеек.

В этой статье мы предоставляем подробные протоколы для пробоподготовки, поверки, сбора и анализа данных для выполнения представленных пробу на коммерческих конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Эксперименты могут выполняться на любом инструменте, оснащенных Фотон подсчета или аналоговые датчики и объективным с высоким числовая апертура. Мы далее обсудить важнейшие шаги протокола и обеспечивают коррекцию схемы для нескольких процессов, вызывая колебания артефакта сигнала, например, детектор шум, Фотообесцвечивание или ячейки движения. Первоначально разработанный прозондирует область взаимодействия между адэрентных клеток, assay может быть изменена для подвески клетки, или адаптированы к модели мембранных систем, например, гигантский однослойных везикул (GUVs) или гигантский плазменный мембрана везикулы (GPMVs), что позволяет количественное определение взаимодействий в средах различных липидов или в отсутствие организованной цитоскелета^12,13.

Сканирование на страницу отдела Флуоресценция кросс корреляции представляет собой модифицированную версию флуоресцентной спектроскопии кросс корреляции¹⁴ и была специально разработана для зонда медленно диффузионное динамика в липидных мембран¹⁵. Он основан на линии сканирования приобретение перпендикулярно вечера, содержащий флуоресцентные белки интерес. Прозондирует область взаимодействия двух видов по-разному помечены белка, приобретение осуществляется в двух спектральных каналов, с помощью двух лазерных линий и два окна обнаружения для спектрально разлученных флуорофоров. Из-за медленного распространения динамики белков в ТЧ (D≤ ~ 1 мкм2/s), кросс talk свободные измерения могут быть выполнены путем чередования схемы возбуждения от линии к линии¹⁵. Анализ начинается с: 1) выравнивания алгоритм исправления для боковых клеточного движения на основе block-wise в среднем ~ 1000 линий, 2) определение положения с максимальной флуоресценции сигналато есть, вечера позиции, в каждом блоке и 3) Ветра из всех блоков для общего происхождения^12,15, отдельно в каждом канале. Затем автоматический выбор пикселов, соответствующих вечера выполняется, выбрав Центральный регион от Гаусса fit суммы все выровненные линии (т.е., центр ± 2.5σ). Интеграция сигнала в каждой строке дает мембраны флуоресценции рядов F(t) в каждом канале (g = зеленый канал, r = красный канал). Обратите внимание, что размер пикселя должна быть небольшой достаточно, например, < 200 Нм, чтобы восстановить форму точки распространения функция и найти свой центр, соответствующие положения пп. При наличии существенных Фотообесцвечивание, флуоресценции временных рядов в каждом канале может быть смоделированы с двойной экспоненциальная функция и затем исправлены с помощью следующей формулы:¹⁶

.    (1)

Важно отметить, что эта формула эффективно исправляет амплитуд и диффузии раз, полученные из корреляционного анализа F(t)^c, по сравнению с оценки параметров, которые будут получены от нескорректированной F(t). Затем, функции auto – и кросс корреляции (ACFs / РСС) флуоресценции сигналы рассчитываются:

, (2).

, (3).

где δF,_я = F,_я(t) – F,_я(t) и я = g, r.

Двумерный диффузионная модель после этого приспособлена для всех корреляционных функций (CFs):

.   (4)

Здесь N обозначает количество флуоресцентных белков объема наблюдения и τ_d диффузии время для каждого канала. Эта модель принимает во внимание, что в параметре описанных экспериментальных, диффузии белков в Личку происходит в плоскости x-z, в отличие от часто используемые конфигурации флуоресценции корреляции спектроскопии (FCS) экспериментов на мембраны зондирование Диффузия в плоскости x-y конфокальный объем¹⁷. Талии w₀ и структура фактора S, описывая удлинение w_z фокуса тома в z, S = wz/w₀, полученные из измерения Калибровка точки FCS, выступал с спектрально аналогичные красители и оптических параметров используя уже имеющиеся значения для коэффициента диффузии D_краска:

, (5).

где τ_{d, краска} это измеренное среднее диффузии время краситель молекулы, полученные из установки модели для трехмерных распространения данных, принимая во внимание переходы дроби T всех N молекул в триплет государство с константой времени τ_τ:

.   (6)

Наконец коэффициенты диффузии (D), значения молекулярных яркости (ε) и относительной кросс корреляции данных sFCCS (rel.cc.) рассчитываются следующим образом:

, (7).

, (8).

, (9).

где G_крест(0) является амплитуда функции кросс корреляции и – амплитуда автокорреляционной функции в i-й канал.

Это определение относительной кросс-корреляции, т.е. вместо Макс означает в уравнение 9, принимает во внимание, что максимальное количество комплексов двух видов белка в различных концентрациях ограничен в меньшее число видов.

Кросс корреляции номер и яркость основан на момент анализа интенсивности флуоресценции для каждого пикселя стека изображений приобрели со временем в фиксированном положении в образце, обычно состоящая из ~ 100-200 фоторамки, с двумя спектральных каналов () g = зеленый канал, r = красный канал). От височной среднего я_я и дисперсией , молекулярный яркость ε_i и число n,_я рассчитываются каждый пиксель и спектральных каналов (я = g, r)¹⁸:

, (10).

. (11)

Важно отметить, что данного уравнения применяются в идеальном случае истинный Фотон подсчет детектора. Для обнаружения аналоговых систем следующие уравнения применяются^19,20:

, (12).

.   (13)

Здесь, S является коэффициент пересчета между обнаруженные фотоны и записи цифровых отсчетов, это шум считывания и смещение ссылается на смещение интенсивности детектор. Как правило эти количества должны калиброванные, для любого типа детектора, основанный на измерении детектор дисперсии в зависимости от интенсивности для постоянного освещения¹⁹, например, отражающей поверхности металла или сушеные краситель решение. Смещение может быть определена путем измерения скорость счета для образца без возбуждения света. Выполнив линейную регрессию детектор связанные дисперсии против интенсивности (я) сюжет, S и могут быть определены¹⁹:

.   (14)

Наконец яркость кросс корреляции вычисляется в каждом пикселе и определяется в целом как²¹

, (15).

где является кросс дисперсии .

Чтобы отфильтровать долгоживущих колебания, все ccN & B расчеты выполняются после крытые вагоны, фильтрация, независимо для каждого пикселя²². Вкратце, n_i, ε,_я (я = g, r) и B_cc рассчитываются в скольжения сегментов например, 8-15 кадров. Таким образом полученные значения можно затем усредняются для получения последней точки номер и яркости.

Стехиометрия анализ
Для того чтобы оценить стехиометрии белковых комплексов в ячейке контактов, молекулярные яркости могут анализироваться отдельно в каждом спектральных канала для sFCCS или ccN & B данных. В sFCCS одно значение яркости получается за измерения в каждом канале. В ccN b & B гистограмма яркости всех пикселей, соответствующий контакт ячеек получается и значение средняя (или средний) может использоваться как представитель яркость для измерения. Выполняя такой же анализ на мономерных ссылку, все значения яркости могут быть нормированы непосредственно получить средний олигомерных состояние обнаруженного белковых комплексов. На данный момент важно исправить на наличие не флуоресцентные FPs, что может привести к недооценке олигомерных государства. Обычно это выполняется путем измерения яркости гомо димерной ссылкой белка^23,–²⁴ с помощью одно цвет sFCS или номер и яркость (N & B).

Protocol

1. Пробоподготовка: Ячеек смешивания Assay Примечание: Следующий протокол описывает перемешивания для адэрентных клеток. Он может быть изменен для клетки культивировали в подвеска. Семя соответствующее количество клеток на тарелке 6-Ну, например, 800000 ГЭС 293T клетк?…

Representative Results

Первый тест для assay взаимодействия протеин протеина, т.е. смешивание клеток, выражая спектрально собственный флуоресцентных белков, следуют sFCCS/ccN & B измерений (рис. 1), должна быть выполнена на белки, которые не ожидается взаимодействие в ячейке конт…

Discussion

Экспериментальная процедура, описанная здесь позволяет расследование протеин транс взаимодействий в ячейке контактов, флуоресценции колебания спектроскопии методы, а именно sFCCS и ccN & B. Эти методы включают статистический анализ флуоресценции колебаний, излучаемых два спектральн…

Materials

DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110