En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

Summary

Det här protokollet beskriver ett fluorescens fluktuation spektroskopi-baserat tillvägagångssätt för att undersöka interaktioner mellan proteiner medla cell-cell interaktioner, dvs proteiner lokaliserade i cell korsningar, direkt i levande celler. Vi tillhandahåller detaljerade riktlinjer på instrumentkalibrering, datainsamling och analys, inklusive korrigeringar till möjlig artefakt källor.

Abstract

En mängd biologiska processer innebär cell-cell interaktioner, typiskt medierad av proteiner som samverkar i gränssnittet mellan angränsande celler. Av intresse klarar bara några analyser av specifikt sondera sådana interaktioner direkt i levande celler. Här presenterar vi ett test för att mäta bindningen av proteiner som uttrycks på ytbehandlar av närliggande celler, på cell-cell kontakter. Denna analys består av två steg: blandning av celler som uttrycker proteinerna av intresse smält till olika fluorescerande proteiner, följt av fluorescens fluktuation spektroskopi mätningar vid cell-cell kontakter med hjälp av en confocal laser skanning Mikroskop. Vi demonstrera genomförbarheten av denna analys i ett biologiskt relevanta sammanhang genom att mäta interaktioner av proteinet amyloid prekursor-liknande 1 (APLP1) över cell cell korsningar. Vi tillhandahåller detaljerade protokoll på dataförvärvet med fluorescens-baserade tekniker (Skanna fluorescens cross-korrelation spektroskopi, cross-korrelation nummer och ljusstyrka analys) och krävs instrument kalibreringar. Vidare diskuterar vi kritiska steg i dataanalys och hur att identifiera och korrigera externa, falska signal variationer, exempelvis på grund av fotoblekning eller cell rörelse.

I allmänhet presenterade analysen är tillämplig på alla homo- eller heterotypic protein-protein interaktioner på cell-cell kontakter, mellan celler av samma eller olika typer och kan genomföras på en kommersiell confocal laserscanning mikroskopet. Ett viktigt krav är stabiliteten i systemet som måste vara tillräckligt sond diffus dynamics av proteinerna av intresse under flera minuter.

Introduction

Många biologiska processer inträffar på platser av cell-cell interaktioner, t.ex., cell-cell adhesion^1,2,3, cell-cell fusion⁴ och cellulära erkännande⁵. Sådana händelser är särskilt viktigt under utvecklingen av flercelliga organismer och för cell-cell kommunikation, exempelvis under immunsvar. Dessa processer är typiskt medierad av proteiner som är lokaliserade på ytan, dvs på plasmamembranet (PM) på angränsande celler och genomgå särskilda interaktioner i cell cell kontakt som är tydligt reglerad i utrymme och tid. I många fall, dessa interaktioner är direkt homo- eller heterotypic protein-protein trans interaktioner, men kan också innebära joner eller ligander egenskap extracellulära linkers¹. Även om det är av grundläggande betydelse, finns det brist på analyser sondera dessa specifika protein-protein interaktioner direkt i den ursprungliga miljön i levande celler. Många metoder antingen kräva cell störningar (t.ex. biokemiska analyser såsom co-immunoprecipitation⁶), fixering (t.ex. vissa super-upplösning optisk mikroskopi tekniker och elektronmikroskopi av cell-cell kontakter⁷), eller är icke-specifika, t.ex. aggregering / vidhäftning analyser^8,9. För att lösa problemet, har fluorescens tekniker genomförts utifrån fluorescens resonans energi överföring (bandet)¹⁰ eller fluorescens komplettering¹¹. Men för att uppnå tillräckligt små avstånd mellan fluorophores, kräver dessa metoder fluorescerande etiketterna på den extracellulära sidan av proteiner¹⁰, potentiellt störa trans interaktioner.

Här presenterar vi alternativa fluorescens-baserat test för protein-protein interaktioner på cell-cell kontakter. Denna strategi kombinerar fluorescens cross-korrelation strategier (skanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi (sFCCS), cross-korrelation nummer och ljusstyrka (ccN och B)) och blandning av celler som uttrycker en fusion konstruktion av proteinet av intresse, t.ex. en vidhäftning-receptorn. De undersökta receptorerna i två samverkande cellerna är märkta med två spektralt separerade fluorescerande proteiner (FPs), från den intracellulära (se figur 1A).

De sysselsatta metoderna baseras på den statistiska analysen av fluorescens fluktuationer inducerad av diffus rörelse av fluorescerande fusionsproteinerna genom fokal volymen av en confocal laser skanning Mikroskop. Mer i detalj sonder analysens samtidig diffusionen av proteinerna av intresse för båda angränsande PMs på cell-cell kontakter. Om proteinerna genomgå trans interaktioner, kommer dessa trans komplex bära fluorescerande proteiner avger i båda spektrala kanaler, orsakar korrelerade fluorescens fluktuationer i både utsläppsländerna. Däremot, om ingen bindning uppstår, blir de antal svängningarna av proteiner i inför PMs oberoende, orsakar inga korrelerade fluktuationer. Förvärv kan utföras på två sätt: 1) sFCCS är baserat på en rad-formade scan hela cell cell kontakten och effektivt sonder samspelet i en plats som ligger i regionen kontakt. Genom en temporal analys av fluorescens svängningar ger sFCCS också dynamics information, dvs Diffusionskoefficienterna av proteinkomplex; (2) ccN & B bygger på en pixel-wise analys av en sekvens av bilder som förvärvats på cell-cell kontakt regionerna. Den har förmåga att söka och karta interaktioner längs hela kontakta region (i ett fokalplan), men ger inte information om dynamics. Båda metoderna kan kombineras med en analys av molekylär ljusstyrka, dvs genomsnittliga fluorescens signal som avges i tidsenheten av enda diffuserande proteinkomplex och, således ge uppskattningar av stökiometri av proteinkomplex på cell-cell kontakter.

I denna artikel tillhandahåller vi detaljerade protokoll för provberedning, instrumentkalibrering, datainsamling och analys att utföra presenterade analysen på en kommersiell confocal laserscanning mikroskopet. Experimenten kan utföras på något instrument utrustat med photon counting eller analoga detektorer och ett mål med hög numeriska bländaröppningen. Vi har ytterligare diskutera kritiska steg i protokollet och ger korrigering system för flera processer som orsakar tingsliga signal fluktuationer, exempelvis detektor buller, fotoblekning eller cell rörelse. Utvecklades ursprungligen för att undersöka samspelet mellan vidhäftande celler, analysen kan ändras för suspension celler eller anpassad till modellen membransystem, t.ex. giant unilamellar blåsor (GUVs) eller giant plasma membranet blåsor (GPMVs), så att den kvantifiering av interaktioner i olika lipid miljöer eller i avsaknad av en organiserad cytoskelettet^12,13.

Scanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi är en modifierad version av fluorescens cross-korrelation spektroskopi¹⁴ och utformades sond långsam diffus dynamics i lipid membran¹⁵. Den är baserad på en linje scan förvärv vinkelrätt till PM som innehåller de fluorescerande proteinerna av intresse. För att undersöka samspelet mellan två olika märkta proteinet arter, utförs förvärvet i två spektrala kanaler med två laserlinjer och två upptäckt windows för spektralt separerade fluorophores. På grund av långsam diffusion dynamiken av proteiner i PM (D≤ ~ 1 µm²per sekund), en cross-talk-gratis mätning kan utföras av omväxlande excitation systemet från linje till linje¹⁵. Analysen börjar med: 1) en justering algoritm korrigera för laterala cell rörelse utifrån block-wise genomsnitt ~ 1000 rader, 2) bestämning av placerar med maximal fluorescens signaldvs PM position, i varje block och 3) skiftande av alla block till ett gemensamt ursprung^12,15, separat i varje kanal. Ett automatiskt val av pixlar motsvarar PM utförs sedan genom att välja regionen centrala från en Gaussisk passform av summan av alla anpassade linjer (dvs center ± 2.5σ). Integration av signalera i varje rad ger membran fluorescens tidsserierna F(t) i varje kanal (g = grön kanal, r = röda kanalen). Observera att pixelstorlek måste vara liten nog, t.ex. < 200 nm, att rekonstruera formen på punkten sprida funktion och hitta dess centrerar, motsvarar positionen för PM. I närvaro av betydande fotoblekning, fluorescens tidsserierna i varje kanal kan modelleras med en dubbel-exponentialfunktionen och sedan korrigeras med följande formel:¹⁶

.    (1)

Det är viktigt att notera att denna formel effektivt korrigerar både amplituder och diffusion gånger erhållits från korrelation analys av F(t)^c, jämfört med parametern uppskattningar som skulle erhållas från den okorrigerade F(t). Sedan funktionerna auto – och cross-korrelation (ACFs / CCFs) av fluorescensen signaler beräknas:

, (2).

, (3).

där δF_jag = F_jag(t) – F_jag(t) och jag = g, r.

En tvådimensionell diffusion modell monteras sedan alla korrelation funktioner (CFs):

.   (4)

Här, betecknar N antalet fluorescerande proteiner i observation volym och τ_d diffusion tiden för varje kanal. Denna modell tar hänsyn att beskrivs i experimentell inställningen diffusion av proteiner i PM uppstår i x-z planet, i motsats till den vanliga konfigurationen av fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) experiment på membran sondering diffusion i x-y-planet av confocal volym¹⁷. Midjan w₀ och struktur faktor S, som beskriver töjning w_z av fokal volymen i z, S = wz/w₀, erhålls från en punkt FCS kalibrering mätning utförs med spektralt liknande färgämnen och samma optiska inställningar använder redan tillgängliga värden för den diffusionskoefficienten D_färgämne:

, (5).

där τ_{d, färgämne} är den uppmätta genomsnittliga diffusion tid av färgämne molekylerna, erhållits från passande modell för tredimensionellt diffusion till data, med hänsyn till konto övergångar av en bråkdel T alla N molekyler till en triplett stat med en tidskonstant τ_τ:

.   (6)

Slutligen beräknas Diffusionskoefficienterna (D), molekylär ljusstyrkevärden (ε) och den relativa cross-korrelationen av sFCCS data (rel.cc.) enligt följande:

, (7).

, (8).

, (9).

där G_cross(0) är amplituden av funktionen cross-korrelation och är amplituden av autokorrelation funktion i jag-th kanal.

Denna definition av den relativa cross-korrelationen, dvs med max istället för menar i ekvation 9, tar hänsyn till att det maximala antalet komplex av två protein arter vid olika koncentrationer begränsas av den arter som finns i ett lägre nummer.

Cross-korrelation nummer och ljusstyrka är baserad på en stund analys av fluorescensintensiteten för varje pixel i en bildstapel förvärvade med tiden till en fast position i urvalet, vanligtvis bestående av ~ 100-200 ramar, med två spektrala kanaler () g = grön kanal, r = röda kanalen). Från temporal medelvärdet jag_jag och variansen , de molekylära ljusstyrka ε_i och nummer n_jag beräknas i varje pixel och spektrala kanal (jag = g, r)¹⁸:

, (10).

. (11)

Det är viktigt att Observera att de givna ekvationerna gäller för det ideala fallet av en sann fotonräknande detektor. För analoga detektionssystem tillämpas följande ekvationer^19,20:

, (12).

.   (13)

Här, S är konverteringsfaktorn mellan upptäckta fotoner och inspelade digitala räkningarna, är utslaget buller och offset hänvisar till detektorn intensitet offset. Generellt, dessa kvantiteter bör kalibreras, för någon Detektortyp, baserat på mätning detektor variansen som en funktion av intensitet för jämn belysning¹⁹, t.ex. en reflekterande metallyta eller torkade dye lösning. Förskjutning kan bestämmas genom mätning räkna räntan för ett prov utan excitation ljus. Genom att utföra en linjär regression av detektor-associerade variansen kontra intensitet (jag) tomt, S och kan vara beslutsamt¹⁹:

.   (14)

Slutligen, cross-korrelation ljusstyrkan beräknas i varje pixel och definieras i allmänhet som²¹

, (15).

där är cross-variansen .

För att filtrera långlivat fluktuationer, utförs alla ccN & B beräkningar efter en boxcar filtrering, självständigt för varje pixel²². Kort, n_i, ε_jag (jag = g, r) och B_cc beräknas i glidande segment av t.ex., 8-15 bildrutor. Erhållits på detta sätt kan vara då medelvärdet för att få den slutliga pixeln nummer och ljusstyrka värden.

Stökiometri analys
För att uppskatta stökiometri av proteinkomplex på cell-cell kontakter, kan molekylär ljusstyrkan analyseras separat för varje spektrala kanal för sFCCS eller ccN & B data. I sFCCS erhålls ett intensitetsvärde per mätning i varje kanal. I ccN & B, ett ljusstyrka histogram över alla pixlar motsvarar den cell-cell kontakten erhålls och värdet genomsnitt (eller median) kan användas som representativa ljusstyrka för mätning. Genom att utföra samma analys på en monomer referens, kan alla ljusstyrkevärden normaliseras för att direkt få den genomsnittliga Oligomera delstaten de upptäckta proteinkomplex. Vid denna punkt, är det viktigt att korrigera för förekomst av icke-fluorescerande FPs som kan leda till en underskattning av Oligomera staten. Detta görs vanligtvis genom att mäta ljusstyrka en homo-dimeriskt referens protein^23,24 använder en färg sFCS eller nummer och ljusstyrka (N & B).

Protocol

1. provberedning: Cell-Cell blandning Assay Obs: Följande protokoll beskriver hur blandning vidhäftande celler. Det kan ändras för celler odlade i suspension. Kärna ur ett lämpligt antal celler på en 6-well platta, exempelvis 800 000 HEK 293T celler (räknat med en Neubauer räknar kammare), en dag innan transfection. Numret kan ändras beroende på vilken tid mellan sådd och transfection och justerat för andra celltyper. För att utföra en grundläggande experimen…

Representative Results

Ett första test för protein-protein interaktioner analysen, d.v.s. blandning av celler som uttrycker spektralt distinkta fluorescerande proteiner följt av sFCCS/ccN & B mätningar (figur 1), bör utföras på proteiner som inte förväntas interagera i cell cell kontakt (dvs. en negativ kontroll). Därför HEK 293T celler som uttrycker myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) eller -mCardinal blandades och sFCCS utfördes över …

Discussion

Den experimentella metod som beskrivs här kan utredningen av protein-protein trans interaktioner på cell-cell kontakter, anställa fluorescens fluktuation spektroskopi tekniker, nämligen sFCCS och ccN & B. Dessa metoder innebär en statistisk analys av fluorescens fluktuationer som avges av två spektralt separerade FPs smält till proteinernas sevärdheter på en kontakt med två angränsande celler, var och en uttrycker en eller den andra fusionsprotein. Förekomsten av trans komplex kvantifieras i…

Materials

DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110