Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

Summary

Este protocolo proporciona una metodología fácil de usar basada en Fiji junto con instrucciones sencillas que explican cómo analizar de manera confiable el comportamiento de la actomiosina en células individuales y tejidos epiteliales curvos. No se requieren habilidades de programación para seguir el tutorial; todos los pasos se realizan de forma semi-interactiva utilizando la interfaz gráfica de usuario de Fiji y los plugins asociados.

Abstract

Los óvulos inmaduros de Drosophila se llaman cámaras de huevo, y su estructura se asemeja a órganos primitivos que sufren cambios morfológicos de una forma redonda a una forma elipsoides durante el desarrollo. Este proceso de desarrollo se llama oogénesis y es crucial para generar huevos maduros funcionales para asegurar la próxima generación de moscas. Por estas razones, las cámaras de huevo han servido como un modelo ideal y relevante para entender el desarrollo de órganos animales.

Se han desarrollado varios protocolos de cultivo in vitro, pero hay varias desventajas en estos protocolos. Se trata de la aplicación de varias cubiertas que ejercen una presión artificial sobre las cámaras de huevo con imágenes con el fin de inmovilizarlas y aumentar el plano de adquisición de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo analizadas. Tal enfoque puede influir negativamente en el comportamiento de la delgada maquinaria de actomiosina que genera el poder de girar las cámaras de huevo alrededor de su eje más largo.

Por lo tanto, para superar esta limitación, cultivamos las cámaras de óvulos Drosophila libremente en los medios de comunicación con el fin de analizar de forma fiable la maquinaria de actomiosin a lo largo de la circunferencia de las cámaras de óvulos. En la primera parte del protocolo, proporcionamos un manual que detalla cómo analizar la maquinaria actomiosina en un plano de adquisición limitada a escala celular local (hasta 15 células). En la segunda parte del protocolo, proporcionamos a los usuarios un nuevo complemento basado en Fiji que permite la extracción simple de una capa delgada definida de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo. A continuación, el siguiente protocolo describe cómo analizar las señales de actomiosina a la escala tisular (>50 células). Finalmente, identificamos las limitaciones de estos enfoques tanto en las escalas celulares y tisulares locales como en su posible desarrollo futuro y posibles aplicaciones.

Introduction

El desarrollo continuo de nuevas tecnologías de imagen y software con aplicaciones en las ciencias de la vida ha proporcionado un enorme impacto en la comprensión de los principios básicos de la vida. Uno de los principales desafíos es la visualización fiable de los procesos de desarrollo en combinación con sus imágenes en vivo en diversos tejidos. Los tejidos son partes de órganos y cuerpos y, como tales, la mayoría no son fácilmente accesibles para la toma de imágenes. Por lo tanto, se han desarrollado protocolos que permiten su disección y el cultivo in vitro con el fin de visualizar eventos biológicos que reflejan suficientemente la situación in vivo dentro de un cuerpo vivo.

Durante las últimas décadas, el cultivo y la toma de imágenes en vivo de las cámaras de óvulos Drosophila, estructuras similares a los acinares que se asemejan a órganos primitivos, ha contribuido inmensamente a la comprensión de los principios básicos del desarrollo primitivo de órganos^{1 , 2 , 3}. Actualmente, hay varios protocolos de cultivo disponibles, y su uso depende del tiempo de adquisición, el tipo de celda a la imagen y su accesibilidad (por ejemplo, línea germinal interna frente a línea somática externa)⁴.

Una característica común en todos estos protocolos de cultivo es la necesidad de la inmovilización de cámaras de huevo analizadas que muestran una alta actividad contráctea en medios líquidos. La actividad contráctea de las cámaras de huevo es causada principalmente por la hoja muscular que cubre una larga cadena de cámaras de huevo conectadas^5,6,7. Por lo tanto, para lograr la inmovilización adecuada de las cámaras de huevo joven, se han desarrollado varios enfoques, que implican cubrir las cámaras de huevo con cubretapas^6,8,9 o mantas flexibles^{4, 10} o incrustarlos en agarosa de punto bajo^3,11. Estos enfoques son populares, ya que también permiten la toma de imágenes de un plano visual más grande debido al aplanamiento sutil de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo.

Sin embargo, recientemente, se ha demostrado que las cámaras de huevo joven (etapa 1-8) giran alrededor de su eje anterior-posterior⁶ y que este movimiento tisular es impulsado por una fina red de actomiosina cerca de la superficie circunferencial de estas cámaras ^{de huevo jóvenes 12}. Por lo tanto, la alteración artificial de la superficie celular causada por un aplanamiento sutil de este tejido puede tener un impacto negativo en el comportamiento de la maquinaria de actomiosina generadora de fuerza. El contrapunto es que si el tejido de la cámara de óvulos no se aplana, la imagen microscópica de proteínas en la superficie circunferencial de las cámaras de óvulos se vuelve aún más limitada por la disminución del tamaño del plano de adquisición.

Por lo tanto, hemos combinado protocolos de Prasad et al.⁹ y el laboratorio de Celeste Berg^4,10 y los hemos modificado para que no se utilice ninguna manta/agarosa flexible en el método desarrollado. Las cámaras de huevo drosofilia se cultivan libremente en los medios de comunicación y el protocolo que se presenta aquí sólo se aplica a la microscopía invertida. Hay dos partes en el protocolo. La primera parte se centra en el análisis de señales de actomiosina a escala celular local (hasta 15 células) dentro de las cámaras de óvulos. En la segunda parte, nos centramos en superar las limitaciones asociadas con un pequeño plano de adquisición causados por el cultivo libre de cámaras de huevo. En este sentido, hemos desarrollado un nuevo método computacional basado en Fiji con una interfaz gráfica de usuario semiinteractiva que extrae selectivamente y despliega capas definidas de una superficie de tejido circunferencial. Esto es seguido por un protocolo que describe cómo analizar la actomiosina a la escala tisular (es decir, >50 células). Como la extracción selectiva de una capa delgada definida de tejidos epitelialescurvos no ha sido fácilmente posible utilizando una proyección clásica de la pila z (Figura 1), este método fácil de usar sirve como un requisito previo importante para entender comportamiento de una red de actomiosina delgada (<1 m) a la escala tisular en las cámaras de óvulos de Drosophila.

Además, para facilitar el protocolo, proporcionamos películas de lapso de tiempo (TM) de ejemplo y archivos de muestra de comportamiento Myosin II convencional no muscular etiquetado fluorescentemente (consulte Archivo complementario 3). La miosina II es una proteína motora y representa la parte contrácta activa de la maquinaria actomiosina. Para la imagen de Myosin II, utilizamos líneas transgénicas Drosophila que contienen una cadena de luz reguladora modificada de Myosin II llamada MRLC::GFP (ver Tabla de Materiales para más detalles)^12,13. Para visualizar las membranas celulares, el protocolo se basa en destisos comerciales (ver Tabla de Materiales). Este protocolo es adecuado no sólo para el análisis de pequeñas señales subcelulares MRLC::GFP^12, sino también para cualquier partícula subcelular de tamaño similar alrededor de 300 m, como las observadas con Life-Act::GFP^12,14.

Aunque ambos protocolos se presentan utilizando cámaras de huevo Drosophila cultivadas in vitro, la adquisición de señales de actomiosina también se puede realizar utilizando otros tejidos tras la optimización de los medios de cultivo y dependiendo de la disponibilidad proteínas etiquetadas fluorescentes con los colorantes comerciales correspondientes o, por ejemplo, microinyecciones de ARNm para obtener perfiles transitorios de expresión génica. Del mismo modo, el protocolo basado en Fiji para la extracción de una capa delgada de una superficie circunferencial se puede aplicar de forma más general a tejidos elipsoides y similares a órganos.

Protocol

NOTA: El siguiente protocolo proporciona instrucciones sobre cómo analizar la actomiosina en la celular local y la escala tisular en las cámaras de óvulos Drosophila. El enfoque a escala local permite a los usuarios analizar el comportamiento detallado de la actomiosina en hasta 15 células por cámara de óvulos y requiere la adquisición de TLM sin antes (5-10 min) mediante el uso de imágenes de alta velocidad y un microscopio confocal invertido. Por el contrario, la escala tisular proporc…

Representative Results

Este protocolo permite a los científicos investigar el comportamiento de las redes de actomiosina en los tejidos epiteliales. Esto sólo es posible cuando un análisis detallado del comportamiento de la actomiosina a escala celular local (unas pocas células) se combina con un análisis similar a la escala tisular (muchas células). Sin embargo, los tejidos epiteliales son a menudo curvos y la extracción de una capa delgada de estos tejidos antes no era fácilmente posible, como se mues…

Discussion

Pasos críticos y solución de problemas para la disección y el cultivo de cámaras de huevo

Si se colocan demasiadas moscas en un vial pequeño, el alimento de la mosca puede volverse fangoso después de 2-3 días debido a grandes cantidades de larvas de alimentación y moscas adultas que quedan atrapadas en la comida de la mosca. En tal caso, voltear el resto de estas moscas en un nuevo vial con alimentos frescos y reducir el tamaño de su número. En particular, excluya a …

Materials

Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 ml Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.