Hur att kvantifiera fraktionen av Photoactivated fluorescerande proteiner i Bulk och i levande celler
Summary
Här presenterar vi ett protokoll som innebär att genetiskt kopplade spektralt distinkta photoactivatable och fluorescerande proteiner. Dessa fluorescerande protein chimärer möjliggöra kvantifiering av den PA-FP-fraktionen som är photoactivated att vara fluorescerande, dvs ljusaktivering effektivitet. Protokollet visar att olika lägen av ljusaktivering ger olika ljusaktivering effektivitetsvinster.
Abstract
Photoactivatable och -konvertibla fluorescerande proteiner (PA-FPs) har använts i fluorescensmikroskopi live-cell för att analysera dynamiken i celler och protein ensembler. Hittills har ingen metod har funnits tillgänglig att kvantifiera i bulk och i levande celler hur många av PA-FPs uttryckt är photoactivated till fluorescerar.
Här presenterar vi ett protokoll som omfattar interna linjaler, dvs genetiskt kopplad spektralt distinkta (photoactivatable) fluorescerande proteiner, till ratiometrically kvantifiera fraktionen av alla PA-FPs uttryckt i en cell som är påslagen för att vara fluorescerande. Användning av detta protokoll, visar vi att olika lägen av ljusaktivering gav olika ljusaktivering effektivitetsvinster. Kort high-power ljusaktivering med en confocal laser skanning Mikroskop (CLSM) resulterade i upp till fyra gånger lägre ljusaktivering effektivitet än hundratals lågaktivt exponeringar tillämpas av CLSM eller en kort puls som tillämpas av widefield belysning. Medan protokollet har exemplifierats här för god Jordbrukarsed (PA-) och (PA-) körsbär, kan det i princip tillämpas på alla spektralt distinkta photoactivatable eller photoconvertible fluorescerande protein par och några experimentella set-up.
Introduction
I 2002 beskrevs de första allmänt tillämpliga photoactivatable (PA-GFP1) och photoconvertible (Kaede2) fluorescerande proteiner. Dessa optiska highlighter fluorescerande proteiner ändra deras spektrala egenskaper vid bestrålning med UV-ljus, dvs de blir ljusa (photoactivatable fluorescerande proteiner, dvs PA-FPs), eller ändra deras färg (photoconvertible FPs). Hittills har flera reversibla och irreversibla photoactivatable och photoconvertible fluorescerande proteiner varit utvecklade3,4. I ensemble eller bulk studier, har optisk överstrykningspennor använts för att studera dynamiken i hela celler eller proteiner och anslutning av subcellulär fack. Dessutom baserade optisk överstrykningspennor aktiverat singel-molekyl superresolution imaging tekniker såsom PALM5 och FPALM6.
Även om den fotokemisken processer under ljusaktivering eller -konvertering har beskrivits för många optiska överstrykningspennor och även kristallografiska strukturer före och efter ljusaktivering / – konvertering har gjorts tillgänglig7 , 8, Foto underliggandefysiska mekanismen av ljusaktivering och -konvertering är inte helt klarlagda. Dessutom hittills bara grova uppskattningar finns av effektiviteten av ljusaktivering och -konvertering, d.v.s. fraktionen av fluorescerande proteiner uttryckt det är faktiskt photoconverted eller photoactivated vara fluorescerande. In vitro ensemble studier rapporterats kvantifiera förskjutningen i Absorptionsspektra och mängden native och aktiverad protein i en gel9,10,11.
Här presenterar vi ett protokoll som omfattar fluorescerande protein chimärer för att bedöma fraktionen av photoactivated fluorescerande proteiner i bulk och i levande celler. När arbetar med genetiskt kodade fluorescerande proteiner, den absoluta mängden protein uttryckt varierar från cell till cell och är okänd. Om en cell att uttrycka en PA-FP visar en ljusare signal efter ljusaktivering än en annan cell, det kan inte göras åtskillnad mellan om denna ljusare signal beror på högre uttryck för PA-FP eller en effektivare ljusaktivering av PA-FP. För att standardisera uttryck nivån i cellerna, införa vi interna linjaler av genetiskt kopplade spektralt distinkta fluorescerande proteiner. Av koppling den genetiska informationen av en photoactivatable fluorescerande protein ett spektralt distinkta alltid-på fluorescerande proteiner, inre linjaler skapas som fortfarande uttrycks på en okänd totala men i en fast och kända relativa mängd 1: 1 denna strategi möjliggör kvantitativa karakterisering av olika UV-ljus ljusaktivering system, dvs bedömning av den relativa mängden PA-FPs som kan vara photoactivated med olika lägen av ljusaktivering och därmed tillåter att definiera ljusaktivering system som är mer effektiva än andra. Dessutom tillåter denna strategi i princip bedömningen av absolut kvantifiering av den photoactivated PA-FP-fraktionen. Därför är det viktigt att inse att studierna som presenteras ensemble är intensitet-baserade vilket gör analysen mer komplex som fastställs i detta protokoll. Parametrar för att fastställa den uppmätta fluorescerande intensitet, dvs olika molekylära ljusstyrka, absorbans och utsläpp spectra och bandet effekter, måste beaktas när man jämför fluorescens intensiteter av olika fluorescerande proteiner.
Presenterade proportionerlig stödnivå-baserade kvantifiering av ljusaktivering effektivitet exemplifieras för PA-GFP och PA-Cherry i levande celler, men i princip är allmänt tillämpliga och kan användas för alla photoactivatable fluorescerande protein under någon experimentella villkor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hittills fanns ingen metod för att bestämma i bulk fraktionen av PA-FPs uttryckt i levande celler som är photoactivated att vara fluorescerande. Presenterade protokollet kan användas för spektralt distinkta fluorescerande protein två. Medan exemplifieras här för den oåterkalleliga PA-FPs PA-GFP och PA-Cherry, är detta tillvägagångssätt i princip tillämplig på photoconvertible proteiner också. Spektralt distinkta fluorescerande proteinet, dock måste väljas noggrant att minimera spektrala överlappning me…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dorigo laboratoriet och neurovetenskap Imaging-tjänsten vid Stanford University School of Medicine för att tillhandahålla utrustning och utrymme för detta projekt.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
