Denne protokollen diagnostiserer Tilapia Lake Virus (TiLV) i tilapia vev bruker RT PCR metoder. Hele metoden er beskrevet fra vev disseksjon til totale RNA utvinning, etterfulgt av cDNA syntese og oppdagelse av TiLV ved konvensjonelle PCR eller kvantitativ PCR bruker dsDNA bindende en fluorescerende bindende fargestoff.
Målet med denne metoden er å lette rask, følsom og bestemt påvisning av Tilapia Lake Virus (TiLV) i tilapia vev. Denne protokollen kan brukes som en del av overvåking programmer, biosikkerhet tiltak og TiLV grunnleggende forskningslaboratorier. Gullstandarden for virus diagnostikk innebærer vanligvis virus aisolering etterfulgt av komplementære teknikker som reverse-transkripsjon polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) for ytterligere bekreftelse. Dette kan være tungvint, tidkrevende og krever vanligvis vevsprøver tungt infisert med virus. Bruk av RT-kvantitative (q) PCR i deteksjon av virus er en fordel på grunn av sin kvantitative natur, høy følsomhet, spesifisitet, skalerbarhet og det raske tid føre. Her, basert hele metoden for PCR tilnærminger for TiLV oppdagelsen er beskrevet, fra tilapia orgel snitt, total ribonukleinsyre (RNA) utvinning bruker en guanidium thiocyanate-fenol-kloroform løsning, RNA kvantifisering, etterfulgt av en to-trinns PCR protokollen innebærer, utfyllende deoksyribonukleinsyre (cDNA) syntese og gjenkjenning av TiLV ved konvensjonelle PCR eller kvantitativ identifikasjon via qPCR bruker SYBR grønne jeg fargestoff. Konvensjonelle PCR krever innlegget PCR trinn og vil bare informere om tilstedeværelse av virus. Sistnevnte tilnærmingen gjør absolutt kvantifisering av TiLV til så lite som 2 eksemplarer, og dermed er svært nyttig for TiLV diagnose i sub kliniske tilfeller. En detaljert beskrivelse av to PCR tilnærminger, representant resultater fra to laboratorier og en grundig diskusjon av kritiske parametere av begge er inkludert for å sikre at forskere og diagnosticians finne mest egnet og gjeldende metoden TiLV gjenkjenning.
Globale innbygger fisken leverer nådde en ny rekord av 20 kg i 2014 og det var kraftig vekst i akvakultur. Akvakultur er fortsatt en av de raskest voksende dyr mat produserende sektorene verden og er bare dyr mat produserende sektoren som vokser raskere enn befolkningen1. Tilapiine cichilds utgjør den nest viktigste ferskvannsfisk oppdrett over hele verden med en total verdensomspennende produksjon av 6.4 millioner tonn (MT) og en estimert verdi på 9,8 milliarder amerikanske dollar i 20152. Ti produsenter av tilapia er Kina (1,78 MT), Indonesia (1.12 MT) og Egypt (0,88 MT), etterfulgt av Bangladesh, Vietnam, Filippinene, Brasil, Thailand, Colombia og Uganda2. Det forventes at globale tilapia produksjon vil være rundt 7.3 MT av 20303. Tilapia har blitt slik en viktig globale matkilde ikke bare fordi de er en billig kilde til protein4 men også fordi de er enkle å rase i kapasitet under en rekke vann og klima forhold5,6. Bare noen tiår siden, var det antatt at det var få kommersielt betydelig sykdommer truende tilapia oppdrett, men dette er ikke lenger sant. En nye viral sykdommen kalles tilapia innsjøen virus sykdom (TiLVD) er den første noensinne kritisk sykdom-epidemien i tilapia og hele bransjen er utsatt. Denne sykdommen har sosio-økonomiske konsekvenser og er en direkte trussel på matsikkerhet for millioner av mennesker i Afrika7, Asia og Sør Amerika. På starten av 2018 rapporterte World Organization for dyr helse (OIE) at den paranoid agenten for denne sykdommen, TiLV, ble offisielt funnet på tre kontinenter dekker åtte land8 og siden denne patogen kortet var oppdatert det har vært rapporter om TiLV i Tanzania, Uganda9, Indonesia10, Taiwan11 og Peru12. TiLV er en roman single-strandet RNA virus beskrevet for å være en orthomyxo-lignende virus fordi den inneholder en rekke egenskaper som minner om andre orthomyoxoviruses som influensa eller smittsomme laks anemi virus (ISAV)13. Det ble først identifisert i kjølvannet av massive tap av ville og Oppdrettede tilapia i Lake i Galilea, Israel14. Deretter referert lignende sykdomsutbrudd til som sommeren dødelighet og en måned dødelighet syndrom knyttet TiLV infeksjon ble rapportert i Nil-tilapia (Oreochromis niloticus) i Egypt15 og Nilen og røde hybrid tilapia (Oreochromis spp.) i Thailand16, henholdsvis. Deteksjon av akvatiske dyr virus er historisk utført av vekst og isolering av virus i cellekultur. Ulike linjer har blitt testet for overføring og isolering av TiLV inkludert E-11 celler avledet fra snakehead fisken (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB og TmB fra Oreochromis mossambicus18, og OnlB og OnlL fra Nilen tilapia (O. niloticus)19. Mens virus kultur har fordelen at det gir materiale for ytterligere eksperimenter, har ulempen at det krever minst 4-7 dager å observere dannelsen av cytopathic effekter (CPE) og avgjørende, ulike piscine virus, som er mer Tilpass til replikering kan overføres og produsere lignende CPE.
I de siste tiårene, har det vært en bevegelse bort fra tradisjonelle, ofte tidkrevende diagnostiske metoder som cellekultur, serologi og antigen oppdagelsen og erstatning med raskere og mer følsom nukleinsyre basert oppdagelsen tester20, 21. Dette er tydelig ved at mange qPCR analyser har blitt utviklet som viktig diagnostiske metoder for en rekke sykdommer i akvatiske dyr, som for ISAV22,23, viral hemoragisk septicaemia virus (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 fordøyelsesfunksjon alphavirus28, fisk iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30og Lymphocystis sykdom virus (LCDV)31 . Robust metoder for diagnostisering og patogen overvåking er presserende nødvendig å redusere spredningen av TiLV. Slike metoder bør tillate tidlig deteksjon av infeksjon før klinisk underskriver utvikle og oppdagelsen av lav virus laster. Hittil har forskjellige PCR protokoller inkludert RT PCR14,32, har nestede RT PCR18, semi nestede RT PCR33og RT-qPCR32,34 blitt utviklet for oppdagelsen av TiLV i fisk vev. En sammenligning av RT-qPCR og virus isolasjon i utsatt linjer for TiLV gjenkjenning avslørte at RT-qPCR 1000 ganger mer følsom enn virus isolasjon32. Selv om hvert publiserte PCR-protokollen har rapportert ulike følsomhet for gjenkjenning av TiLV, er de fleste analyser svært følsomme med oppdagelsen grensene av viral Kopier 7,5 Kopier33, 7 eksemplarer18 eller 2 Kopier32 per reaksjon.
Målet med denne metoder artikkelen er å forklare i detalj hvordan du utfører TiLV gjenkjenning analyser, starter med tilapia vev samling, til totale RNA utvinning, cDNA syntese og TiLV bestemte PCR basert analyser. Spesielt har omfattende protokoller av både konvensjonell RT PCR, og også SYBR green-baserte RT-qPCR blitt beskrevet å appellere til et bredt spekter av forskere å oppdage TiLV. Tidligere er mindre sensitive, men er vanligvis et billigere alternativ for gjenkjenning. Sistnevnte krever mer forseggjort infrastruktur som en kvantitativ PCR-maskin og dyrere reagenser, men det har fordelene av å være kvantitative, rask og svært følsom, betyr at det kan bli brukt for påvisning av TiLV i sub klinisk infisert fisk. RT PCR og RT-qPCR protokollene ble utført i to forskjellige laboratorier med forskjellige geografiske isolater av TiLV og inkludert resultater markere følsomheten og reproduserbarhet av analyser beskrevet her.
TiLV ble først rapportert i 2014 i Israel14 og siden da har det blitt identifisert i flere land, inkludert Egypt, Colombia, India, Malaysia, Uganda, Tanzania og Thailand15,16,18, 35 , 48. global bevissthet, særlig tilapia produksjon har plassert mer oppmerksomhet om virus og ulike restriksjoner og kontrolltiltak fra myndigheter har implementert prøver å hindre spredning av TiLV. Her har en detaljert protokoll for TiLV gjenkjenning i tilapia vev, dekker prøvetaking, RNA isolasjon, cDNA syntese, PCR og qPCR analyser blitt forklart. Det er ulike aspekter ved disse metodene som garanterer bestemt diskusjon. TiLV har blitt identifisert i fisk spenner over en rekke størrelser9,12,14,15,49 og arter av tilapia så langt, inkludert oppdrettet hybrid tilapia (O. niloticus x O. aureus)11,14, Nilen tilapia (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 og røde tilapia (Oreochromis sp.)16,33,48,51, så vel som vill Nilen tilapia9,12, svart tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, O. aureus og T. simonis intermedia14 og nylig TiLV ble identifisert i vill karpe (Barbonymus schwanenfeldii)52. Vevsprøver fra indre organer (gill, milt, lever, hjerte, hodet nyre) eller Slim37 kan samles fra sunn samt døende tilapia uavhengig av alder, størrelse eller arter og behandlet for RNA isolasjon. Totalt RNA utvinning protokollen skissert bruker her en monophasic løsning av fenol og guanidinium thiocyanate, som er en chaotropic denaturing agent. Vev er direkte homogenisert i denne løsningen etterfulgt av kloroform og sentrifugering å oppnå fase separasjon der en klar RNA inneholder øvre vandige fasen, en interphase og en lavere organisk fase genereres. RNA er isolert fra den vandige fasen av isopropanol nedbør, etterfulgt av vask av den gjenopprettede å kvitte seg med forurensninger. Isolasjon av ved denne metoden ble utviklet av Piotr Chomczynski og Nicoletta Sacchi, og ble omtalt som guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform utvinning53,54. Denne typen reagens som brukes for RNA utvinning kan være kommersielt kjøpt eller laget i laboratoriet (se Tabell for materiale for mer informasjon). Denne protokollen tar litt lengre enn kolonne-baserte metoder som rensing silisium-basert, men generelt, det er mer kostnadseffektivt og gir mer RNA.
I denne protokollen, kvantifisere RNA bruke A260 ble beskrevet der spectrophotometry verdier kan angi RNA kvalitet (A260/A280 = 1,9-2.1). Mens denne metoden vil gi en god indikasjon på prøven renhet, kan det absolutt informere om kvaliteten på den utpakkede RNA. Å riktig avgjøre om RNA er intakt eller delvis degradert, prøver kan være separasjon av agarose gel geleelektroforese der smøre på EtBr farget 18S og 28S rRNA band angir RNA degradering. Ytterligere bekreftelse av RNA kvalitet kan inkluderer bruk av en lab på-chip instrument. Videre er det også viktig å fordøye det renset RNA med DNase jeg fjerne forurensende vert genomisk DNA, som avhengig av nedstrøms programmene kan føre til falske resultater. Hvis verten gDNA er fortsatt forurensende RNA prøven i stor grad, en ekstra DNaseI behandling kan også utføres på slutten av RNA utvinning prosedyren (se Tabell for materiale).
Komplementære DNA-syntese kan sterkt påvirke de samlede qPCR-resultatene og er en del av metoden som kan introdusere variasjon. CDNA protokollen orde her består av en enkelt komponent oppsett bruker oligo (dT) og dermed bare transcribes mRNAs som inneholder polyA haler. Den lar brukerkontroll av nøyaktig hvilke komponenter til bruk i omvendt transkripsjon reaksjonen og denne modusen for cDNA syntese har vist seg vellykket TiLV gjenkjenning32. Et alternativ til dette oppsettet er et kommersielt kjøpte master-blanding som inneholder alle komponentene som kreves for omvendt transkripsjon reaksjonen og er meget raskt og enkelt uten vanlig flere trinn, pipettering og flere temperatur protokollen. Dette er en fordel fordi det reduserer håndtering og fremmer ensartethet over alle prøvene. Slike master-mikser inkluderer ofte både oligo(dT) og tilfeldig primere gjør det gjelder ulike RNA maler og genererer representant cDNA kopier av sekvenser fra hele lengden av RNAs i en befolkning (viral og tilapia vert mRNA) og i teorien, hver ønsket RNA arter kan deretter måles ved konvensjonelle PCR eller qPCR fra slik en prøve. Denne allsidigheten er den største fordelen med en 2-trinns RT PCR tilnærming; Det gir en langsiktig basseng som kan brukes til mange forskjellige eksperimenter. I resultatene, en ettrinns RT PCR tilnærming har vært representert der rekkefølgen bestemt primere (tabell 1) ble brukt og RT og PCR ble utført i en tube (se materiale). Generelt, sekvens bestemt primere tillate en høyere RT effektiviteten av bestemt målet RNA enn å bruke tilfeldige grunning, men bestemt målet RNA er den eneste som kan kvantifiseres i slike et cDNA utvalg som kan være det eneste målet for visse laboratories (se Tabell over materialer cDNA syntese produkt forslag).
Mens konvensjonelle RT PCR synes å bli brukt så langt i TiLV diagnose9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR har vist seg å være et kraftigere verktøy for deteksjon og kvantifisering av små mengder TiLV i fisk vev eller Slim32,37. Generelt er qPCR mye brukt i klinisk virologi diagnostiske labs dens høy følsomhet, spesifisitet, god reproduserbarhet, bredt dynamisk område og hastighet21. Mens qPCR kan være utgangspunktet dyrere å implementere enn konvensjonelle RT PCR, tilbyr det mange viktige fordeler fremfor konvensjonelle PCR; den har en raskere snu-tid fra prøven resultater og krever ikke alle innlegg PCR skritt. Dette siste punktet betyr at det er minimal risiko for laboratoriet forurensning og det kan være mer lett tilpasses høy gjennomstrømming situasjoner som ved utbrudd. Det er iboende mer følsom enn konvensjonelle RT PCR, som er av avgjørende betydning å oppdage lav viral belastning i sub klinisk infeksjoner21. Dette ville kreve en nestede PCR tilnærming krever omvendt transkripsjon, to ytterligere PCR reaksjonene og analyse av agarose gel geleelektroforese. Følgende mange tar mye tid og øke sjansene for feil eller forurensning. Likevel, på grunn av dens høy følsomhet, RT-qPCR krever nitid eksperimentell design og en grundig forståelse av kvantifisering teknikker for å generere nøyaktige resultater56,57.
DNA bindende fluorophore, SYBR Green jeg har vist i denne protokollen. Det er en dsDNA uspesifikke DNA bindende fargestoff og dermed spesifisiteten av analysen ligger helt i settet med primere, som kan generere falske positiver58. Derfor, mens dsDNA smelter curve analyse utført på slutten av hver PCR er en særlig viktig del av PCR reaksjonen fordi den bekrefter at eneste PCR amplicon riktig tm er produsert (dette bør også oppnås ved gel geleelektroforese når nye analyser blir implementert). Tm av et DNA-fragment er avhengig av en rekke funksjoner som sin lengde, GC komposisjon, sekvens, strand komplementaritet, konsentrasjon så vel som på buffer komponenter og PCR enhancers. Smeltende kurve analysene i representant resultatene vises fra to laboratorier ikke avsløre tilstedeværelsen av primer-dimers eller andre uønskede PCR-produkter, men hvis dette er observert med andre eksempler og/eller eksperimentelle oppsetninger, så analysen bør være nytt optimalisert. Mer avansert qPCR teknologi krever ikke slikt smeltende kurve skritt og faktisk, siden dette metoder papir ble skrevet, en TaqMan basert TiLV RT-qPCR er utviklet to grunninger og en sonde gjør det svært TiLV bestemt34.
Utvilsomt, grunning designet for RT-qPCR analyser er grunnleggende for suksessen til analysen og primerne her ble designet basert på offentlig tilgjengelig TiLV genomic dataene på den tid32. Men RNA-virus er velkjente viser høy mutasjon priser og mulig stammer unnslippe de gjeldende diagnostiske testene, som ble observert i ISAV59. Det vil alltid være vanskelig for slike virus typer generere en universell pan-TiLV RT-qPCR analysen og slike analyser bare stadig vil forbedres hvis flere TiLV genomic data fra vidtrekkende steder og tidsperioder blir tilgjengelige.
Til slutt, er det viktig å kjøre identiske eller hvis mulig, tre eksemplarer reaksjoner i begge intra og inter qPCR analyser. Hvis Ct verdiene er svært høy, så er bruk av replikat spesielt viktig å fastslå at PCR reaksjonen er pålitelig og reproduserbar. Generelt, hvis data fra repliserer reaksjoner varierer mer enn 0,5 sykluser, reaksjonene skal gjentas og hvis Ct verdiene konsekvent varierer > 0,5 sykluser i replikerer, analysen bør optimeres re. Bruk av en integrert qPCR pipettering robot hjelper utrolig med dette problemet, men det er en luksus-verktøyet. Som med alle eksperiment er inkludering tilstrekkelig og riktig kontrollene av største betydning for utviklingen av robust molekylær analyser, spesielt i laboratorier hvor slike analyser må være akkreditert. Kontroller bør inneholde positive (positiv TiLV eksempel, TiLV plasmider standard) og negative kontroller (NTC og -RT) prøver, i tillegg til oppdagelsen av endogene tilapia housekeeping gener. Slike kontroller kan ikke undervurderes og bør inkluderes i hver analysen å riktig forstå kvaliteten på hvert trinn i analysen og riktig tolke resultatene.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til instituttet av veterinær bakteriell, Vetsuisse fakultet, Universitetet i Bern for deres støtte. Dette arbeidet ble finansiert av komiteen for akademiske forfremmelse av tidlig karriere forskere og likestilling ved Vetsuisse fakultet, Universitetet i Bern av 120% modell finansiering til PN. WS og PR støttes av Center for Advanced Studies for landbruk og mat, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under høyere utdanning forskning fremme og National Research University prosjektet i Thailand, Office av høyere utdanning provisjon, Utdanningsdepartementet, Thailand. Vi vil gjerne takke Dr. Kwanrawee Sirikanchana for hennes lydkommentarer og Piyawatchara Sikarin for redigering av video.
Tissue collection | Step 1 | ||
Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative to clove oil. Step 1.1 |
RNAlater stabilization solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | For storing tissues if they cannot be processed immediately Step 1.3 |
RNA extraction | Step 2 | ||
TRIreagent | Sigma-Aldrich | Step 2.1 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 15596026 | Step 2.1 |
GENEzol | Geneaid | GZR100 | Step 2.1 |
Trisure | Bioline | BIO-38032 | Step 2.1 |
Homemade solution | - | - | 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 30.45 g/L (400 mM) ammonium thiocyanate 8.20 g/L (100 mM) sodium acetate 380 mL/L (38 % v/v) phenol 50 mL/L (5 % v/v) glycerol 1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 Store up to 2 years at 4oC Step 2.1 |
MagNA Lyser Green Beads | Roche | 3358941001 | An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below Step 2.2 |
Lysing Matrix D, 2 mL Tube | MP BIOMEDICALS | 116913050 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Step 2.3 |
Chloroform | RCI Labscan | AR1027E-G2.5L | Step 2.3 |
1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B9673 | A less toxic alternative to chloroform Step 2.3 |
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % | Sigma-Aldrich | 59300 | Step 2.6 |
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.09634.2500 | Step 2.6 |
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) | Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) | R0551 | Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation optional |
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % | Sigma-Aldrich (EMD Millipore) | 1.00983 | Step 2.9 |
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck (EMSURE) | 1.00983.2500 | Step 2.9 |
Nuclease-free water | Promega | P1193 | Step 2.13 |
Nuclease-free water | Multicell | 809-115-CL | Step 2.13 |
Ambion TURBO DNA-free kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM1907 | Can be performed at the end of the RNA extraction protocol optional |
cDNA synthesis | Step 4 | ||
Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis | cDSK01 | Step 4.1 & 4.3 |
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover | Toyobo | A1172K | An alternative option see discussion |
ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | An alternative option see discussion |
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase | Agilent Technologies | 600107 | An alternative option |
PCR | Step 5 | ||
DNA polymerase systems: | Step 5.2 | ||
– Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 14001012a | Step 5.2 |
– GoTaq Mastermix | Promega | M7122 | Step 5.2 |
Separate PCR mixture components: | Step 5.2 | ||
10mM dNTP Mix | Vivantis | NP2409 | Step 5.2 |
25mM MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | R0971 | Step 5.2 |
10X Taq Buffer with KCl | Thermo Fisher Scientific | 00348114 | Step 5.2 |
Taq DNA polymerase | Vivantis | PL1202 | Step 5.2 |
– Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq | Thermo Fisher Scientific | AB1454 | One step RT-PCR exemplified in Figure 3B |
Gel electrophoresis: | For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4 | ||
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 17898 | Step 5.5 |
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: | Step 5.5 | ||
– Tris | Vivantis | PR0612-1KG | Step 5.5 |
– Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.00063.2500 | Step 5.5 |
– Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BIO-RAD | 161-0729 | Step 5.5 |
Agarose | Vivantis | PC0701-100G | Step 5.5 |
DNA ladders and markers | Vivantis | NL1405 | Step 5.5 |
DNA gel loading dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Step 5.5 |
qPCR | Step 6 | ||
PowerUP SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | A25779 | Exemplified in Figures4-6B Step 6.2 |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | 1725120 | Exemplified in the video and in Figures 4-6A Step 6.2 |
Equipment | |||
Dounce tissue grinder pestle | Sigma-Aldrich | P1110 | Protocol 2 |
MagNA Lyser Instrument | Roche | 3358976001 | An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above Step 2.2 |
FastPrep-24 5G Homogenizer | MP BIOMEDICALS | 116005500 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5427R | Protocol 2 Step 2.4, 2.7 & 2.10 |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5418R | |
Heat box | Labnet | AccuBlock Digital Dry Bath | Protocol 2 Step 2.13 |
Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | Nanodrop 2000 | Protocol 3 Step 3.1 – 3.4 |
PCR machine | BIO-RAD | T100 Thermal Cycler | Protocol 5 Step 5.4 |
Power supply | BIO-RAD | PowerPac HC | Protocol 5 Step 5.5 |
Horizontal gel electrophoresis | BIO-RAD | Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu | Protocol 5 Step 5.5 |
Mini microcentrifuge | Corning | LSE 6766 | Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6 Step 6.5.1 |
Microcentrifuge | LioFuge | LM-60 | Step 6.5.1 |
qPCR machine and software | Thermo Fisher Scientific | 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 | Protocol 6 Step 6.6-6.8 |
qPCR machine and software | BIO-RAD | CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software | |
General Materials | |||
Mayo scissors | Step 1.1-1.2 | ||
Forceps | Step 1.1-1.2 | ||
Pipette | Rainin | Pipette-Lite XLS | |
Aerosol-barrier pipette tips | Sigma-Aldrich | Z333328, Z333336, Z333344 | |
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf |