Alteraciones en la tasa metabólica es central para entender la progresión de varias enfermedades y envejecimiento. Aquí, presentamos una nueva técnica para medir el consumo de oxígeno toda cabeza que más estrechamente se asemeja el estado fisiológico y puede ayudar a revelar nuevos fármacos que modifican la actividad mitocondrial.
Regulada actividad metabólica es esencial para el funcionamiento normal de las células vivas. De hecho, actividad metabólica alterada causal está relacionada con la progresión de cáncer, diabetes, neurodegeneración y envejecimiento para nombrar unos pocos. Por ejemplo, cambios en la actividad mitocondrial, potencia metabólica de la célula, se han caracterizado en este tipo de enfermedades. En general, las tasas de consumo de oxígeno de las mitocondrias eran consideradas una lectura fiable de la actividad mitocondrial y medidas en algunos de estos estudios se basan en células o mitocondrias aisladas. Sin embargo, tales condiciones no pueden representar la complejidad de un tejido entero. Recientemente, hemos desarrollado un novedoso método que permite la medición de las tasas de consumo de oxígeno de cabezas de mosca completamente aisladas. Mediante la utilización de este método, hemos registrado tasas más bajas de consumo de oxígeno del segmento todo cabeza en jóvenes versus de moscas. En segundo lugar, hemos descubierto que los inhibidores de la deacetilasa lisina alteran rápidamente el consumo de oxígeno en toda la cabeza. Nuestra novedosa técnica por lo tanto puede ayudar a descubrir nuevas propiedades de diversos fármacos, que pueden afectar la tasa metabólica. Además, nuestro método puede dar una mejor comprensión del comportamiento metabólico en un montaje experimental que se parece más a Estados fisiológicos.
Regulada actividad metabólica es esencial para la supervivencia de las células y la función saludable del tejido. Actividad metabólica desregulado ha demostrado ampliamente ligado a la aparición y progresión de varias enfermedades1. Por ejemplo, menor actividad metabólica fue descrita anteriormente en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el deterioro de memoria asociado a la edad2,3. Además, la disfunción mitocondrial se cree que es causalmente implicados en el proceso de envejecimiento4,5. Por otra parte, tasas metabólicas y mitocondriales fueron descritas en cáncer células6, donde el uso de inhibidores mitocondriales reducido tumorigenesis7.
Una lectura de la actividad metabólica es la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de las mitocondrias. Curiosamente, este tipo de lectura se obtiene principalmente de las mitocondrias aisladas o las células, así la mayoría de lo que se describe en la literatura se basa en una lectura que no se asemeja el estado fisiológico. Sin embargo, hay varios inconvenientes a esta técnica. En primer lugar, el protocolo de aislamiento mitocondrial puede dañar potencialmente su integridad8, que puede ser un artefacto relevante cuando se comparan las mitocondrias aisladas de joven versus más viejos tejidos9. Además, el proceso de aislamiento es largo y puede resultar en pérdida de modificaciones postraduccionales de las proteínas que regulan la función mitocondrial9,10,11. Por otra parte, se ha demostrado que las mitocondrias aisladas no representan constantemente todo tejido tasa metabólica12,13. Tal complejidad biológica celular puede considerarse como, ‘el todo es mayor que la suma de sus partes’, es decir, de las mitocondrias pueden mostrar diferentes tasas metabólicas dentro de una célula compleja en comparación con su tasa metabólica cuando están aisladas.
Mientras que las células pueden ofrecer una mejor lectura de OCR que las mitocondrias aisladas, comunicación de célula a célula en el contexto de un tejido todo puede perderse. Por ejemplo, en el cerebro, la actividad metabólica de las neuronas es altamente dependiente en la actividad metabólica de las células gliales vecinas14. Como tal, establecer nuevas técnicas para investigar OCR en todo tejido u organismos enteros puede resultar más perspicaz para la aparición y progresión de varias enfermedades.
Recientemente, han surgido nuevas técnicas para abordar estos temas y permitir la medición de OCR de todo tejido, segmento u organismos vivos. Por ejemplo, un trabajo reciente informó la medida de oxígeno de un músculo de vuelo de escarabajo usando un acercamiento de fibra permeabilized con un respirómetro15. Nuevas máquinas para micro-respirometría permiten la medición de OCR de islotes pancreáticos16,17. En consecuencia, se ha reportado que esta tecnología permite la medición de OCR de todo gusanos18 y19de pez cebra. Sin embargo, la presencia de la barrera digestiva puede plantear un desafío para probar diferentes medicamentos en el contexto de alteraciones de OCR. Curiosamente, los informes recientes por Neville y sus colegas han demostrado una nueva técnica para medir el cerebro de la larva de drosophila solo con la placa bien20,21.
En este estudio, hemos utilizado una instalación similar que permita la medición de todo OCR de vida entera y no móviles Drosophila22. Esta técnica también ofrece una ventaja secundaria en medir el impacto de distintas drogas en la actividad metabólica en un segmento entero, sin tener que pasar por el sistema digestivo barrera13,22. Por ejemplo, fue demostrado previamente que inyección directa de inhibidor de la deacetilasa de lisina (KDACi), una droga cree para alterar el mecanismo epigenético en el cerebro, dio lugar a una formación mejor memorias del23. No obstante, utilizando nuestra nueva técnica, hemos descubierto que la inhibición de la KDAC dio lugar a un rápido incremento de OCR, que puede ser un factor que contribuye por sí misma en la actividad neuronal. Nuestro protocolo proporciona un método simple y novedoso para evaluar el impacto de distintas drogas, manipulación genética o Estados fisiológicos (enfermedades, envejecimiento) en OCR en el contexto de una cabeza entera.
Nuestra nueva técnica ofrece un nuevo enfoque para estudiar los cambios metabólicos en el envejecimiento y la enfermedad en el contexto de toda mosca segmentos cabeza22. El método también puede ser adecuado para estudiar el impacto KDAC de butirato de sodio en el consumo de oxígeno. Como hemos demostrado, inhibidores de la deacetlyase de lisina (HDACs/KDACs) provocar cambios de OCR. Esencialmente, los objetivos de estos inhibidores no se localizan en las mitocondrias (estos inhibidores no afectan la deacetilasas clase III, las sirtuinas)24, estos medicamentos sólo podrían ser probados en un mínimo nivel de tejido. De hecho, varios medicamentos se inyectan directamente al cerebro, evitando así posible transformación/modificación/inactivación por el sistema digestivo. Como tal, nuestra técnica ofrece una visión novedosa cómo tales drogas directamente impacto el segmento cabeza.
Hay varios pasos críticos. En primer lugar, como se indica en el protocolo, le recomendamos preparar una placa de una hora, con dos pares de manos preparando la placa. Desde nuestra experiencia, la calidad y la estabilidad de las mediciones de OCR son mejores si se prepara de una manera oportuna. Cuando se toma demasiado tiempo, la ocurrencia de baja pozos mucho de OCR está aumentando, así como la duración más corta de OCR estable. En segundo lugar, es importante efectuar un control de calidad y asegurar que las condiciones experimentales entre varias muestras son similar (pH, niveles de oxígeno). Finalmente, un paso crítico es elegir el algoritmo correcto para analizar las muestras. Como hemos demostrado, el algoritmo predeterminado AKOS rindió un cálculo engañoso y a veces oposición en muestras que consumen oxígeno a tasas elevadas13. Por lo tanto, recalcamos la importancia de la comprobación de los datos en bruto para los niveles de oxígeno y la comparación de la OCR resultante.
Actualmente, existen varias limitaciones con esta técnica. A temperatura ambiente, la máquina calienta hasta 31 ° C (esta es la mínima temperatura de medición, mientras la máquina está a temperatura ambiente), que puede representar un estado de estrés para el volar cabezas25. Esto sin embargo puede ser superado colocando la máquina en un cuarto frío, que le permiten realizar mediciones a 25 ° C y por lo tanto sin una posible insolación a las cabezas de mosca. Informe reciente ha demostrado poner la máquina a 11 ° C, lo que permite la grabación de OCR de moscas a los 25 ° C21. Sin embargo, la separación de cabeza mosca debe realizarse a temperatura ambiente. Además, las fluctuaciones de temperatura hacen difícil control cambios en el pH y por lo tanto es muy recomendable para probar el impacto de las condiciones fisiológicas, drogas en OCR mediante montajes experimentales similares. Además, la contribución del consumo de oxígeno por mecanismos no mitocondrial independiente no ha sido todavía establecido26. Mediante el uso de diferentes inhibidores respiratorios que son eficientes para cabezas de mosca, sería posible establecer estas tasas de consumo de oxígeno no mitocondrial.
Cabe destacar que varias enfermedades mamíferos se caracterizan por alteraciones en el metabolismo energético. Entre ellos son enfermedades que se caracterizan por cualquier reducción metabólica como la enfermedad de Alzheimer o metabólicas cableado como el cáncer. Curiosamente, los inhibidores de la KDAC se utilizan para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y cáncer27. Si bien los mecanismos precisos por los que KDAC inhibidores están logrando el aspecto terapéutico siguen siendo confusos, los datos de nuestra técnica apoyan la noción de novela que estos inhibidores pueden modular el metabolismo.
En Resumen, este método es valioso para medir el consumo total de oxígeno precios en vivo y más exactamente muestra efectos de drogas sobre el metabolismo general, que puede ser pasado por alto en mitocondrias aisladas protocolos12. Por ejemplo, resultados obtenidos con este método, en lugar de las técnicas anteriores, han implicado nuevos insights para inflexibilidad metabólica asociado a la edad sobre el tratamiento de KDAC. Mientras que el trabajo adicional es necesario para optimizar las condiciones experimentales para volar cabezas, la combinación de nuestra técnica y análisis adecuado puede llevar a más aclaración de la actividad mitocondrial en el contexto de los tejidos vivos todo.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Andreas Ladurner, Carla Margulis y su equipo de amplio soporte experimental. Agradecemos sus comentarios sobre el manuscrito Caitlin Ondracek. Nos gustaría agradecer a Sofía Vikstrom por asistirnos en el establecimiento de las primeras fases de esta técnica. Agradecemos también puede Sanderhoff por su ayuda técnica. LB es financiado por el Ministerio Federal alemán de educación e investigación (Infrafrontier beca 01KX1012). SP fue financiado por una beca postdoctoral de AXA Research Fund y la NSFC (número 81870900). AVV es financiado por el QBM.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |