Optogenetisk manipulation av neurala kretsar under övervakning sömn/vakenhet stater hos möss
Summary
Här, vi beskriver metoder för optogenetisk manipulation av vissa typer av nervceller under övervakning av sömn/vakenhet stater i möss, presentera vårt senaste arbete på sängen kärnan i stria terminalis som ett exempel.
Abstract
Under de senaste åren har optogenetik ofta använts inom många områden av neurovetenskaplig forskning. I många fall, en opsin, såsom Channel rhodopsin 2 (ChR2), uttrycks av en virusvektor i en viss typ av neuronala celler i olika CRE-driver möss. Aktivering av dessa opsins utlöses av tillämpning av ljuspulser som levereras av laser eller leds genom optiska kablar, och effekten av aktivering observeras med mycket hög tid upplösning. Försöksledaren kan akut stimulera nervceller medan övervakning beteende eller ett annat fysiologiskt utfall hos möss. Optogenetics kan möjliggöra användbara strategier för att utvärdera funktionen av neuronala kretsar i regleringen av sömn/vakenhet stater i möss. Här beskriver vi en teknik för att undersöka effekten av optogenetisk manipulation av nervceller med en specifik Kemisk identitet under elektroencefalogram (EEG) och Elektromyogram (EMG) övervakning för att utvärdera sömn stadiet av möss. Som ett exempel, vi beskriver manipulation av GABAergic neuroner i sängen kärnan i stria terminalis (BNST). Akut optogenetisk excitation av dessa nervceller utlöser en snabb övergång till vakenhet när de appliceras under NREM-sömn. Optogenetisk manipulation tillsammans med EEG/EMG inspelning kan tillämpas för att dechiffrera neuronala kretsar som reglerar sömn/vakenhet stater.
Introduction
Sömn är viktigt för optimal kognitiv funktion. De senaste rönen tyder också på att sömnstörningar i sömnen är förknippade med ett brett spektrum av sjukdomar1,2,3. Även om funktionerna i sömnen är ännu i stort sett olösta, betydande framsteg har gjorts nyligen i förståelsen av neurala kretsar och mekanismer som styr sömn/vakenhet stater4. Hos däggdjur finns det tre tillstånd av vaksamhet: vakenhet, icke-Rapid ögonrörelser (NREM) sömn, och snabba ögonrörelser (REM) sömn. Vakenhet kännetecknas av snabba EEG svängningar (5-12 Hz) av låg amplitud med målmedveten och ihållande motorisk aktivitet. NREM-sömnen definieras av långsamma svängningar (1-4 Hz) av kick amplitud (delta vinkar), med brist av medvetenhet och målmedveten motorisk aktivitet. REM-sömn karakteriseras av förhållandevis fastar svängningar (6-12 Hz) av låg amplitud och nästan färdig bilateral muskel Atonia5.
Borbely föreslog en teori om sömn-vakenhet förordning kallas två processmodell6,7. En homeostatiska process, även kallad process S, representerar sömn tryck som ackumuleras under vakenhet och skingpates under sömnen. En annan process, kallad process C, är en Cirkadisk process, vilket förklarar varför vaksamhets nivåerna fluktuerar i 24 h cykel. Förutom dessa två processer, allostatiska faktorer är också viktiga för regleringen av sömn/vakenhet8,9. Allostatiska faktorer inkluderar näringsmässiga stater och känslor. Rädsla och ångest åtföljs vanligtvis av en ökning av upphetsning tillsammans med autonoma och neuroendokrina svar10,11,12. Det limbiska systemet tros spela en roll i regleringen av rädsla och ångest, och mekanismerna bakom autonoma och neuroendokrina svar har studerats utförligt, men den väg genom vilken det limbiska systemet påverkar sömn/vakenhet stater har inte ännu inte avslöjats. Ett stort antal nyligen genomförda studier med OPTO-och Farmakogenetik har föreslagit att nervceller och neuronala kretsar som reglerar sömn/vakenhet stater distribueras i hela hjärnan, inklusive cortices, basal forebrain, Thalamus, hypothalamus, och hjärnstammen. I synnerhet har de senaste framstegen inom optogenetik tillåtit oss att stimulera eller hämma specifika neurala kretsar in vivo med höga rumsliga och temporala resolutioner. Denna teknik kommer att möjliggöra framsteg i vår förståelse av de neurala substrat för sömn och vakenhet, och hur sömn/vakenhet stater regleras av dygnsrytm processer, sömn tryck, och allostatiska faktorer, inklusive känslor. Detta dokument syftar till att införa hur man använder optogenetisk manipulation kombinerat med sömn/Wake inspelning, som kan ha potential att uppdatera vår förståelse av de connectomes och mekanismer i hjärnan som spelar en roll i regleringen av NREM sömn, REM-sömn, och vakenhet. Förståelse för denna mekanism genom vilken det limbiska systemet reglerar sömn/vakenhet stater är av största vikt för hälsan, eftersom sömnlöshet är vanligtvis förknippas med ångest eller rädsla för att inte kunna sova (somniphobia).
BNST tros spela en viktig roll i ångest och rädsla. Gad 67-uttrycker GABAergic neuroner är en stor population av bnst12,13. Vi undersökte effekten av optogenetisk manipulation av dessa nervceller (GABABnst) på sömn/vakenhet stater. En av de största framstegen inom neurovetenskap under de senaste åren har varit metoder som möjliggör manipulation av nervceller med särskilda kemiska identiteter in vivo, med hög rumsliga och temporala resolutioner. Optogenetik är mycket användbart för att demonstrera orsakssambanden mellan neurala aktivitet och specifika beteendemässiga svar14. Vi beskriver optogenetik som en metod för att undersöka funktionell anslutning av definierade neurala kretsar i regleringen av sömn/vakenhet stater. Genom att utnyttja denna teknik, stora framsteg har uppnåtts i förståelsen av neuronala kretsar som reglerar sömn/vakenhet stater15,16,17,18,19 . I många fall, opsins är specifikt introduceras i nervceller med särskilda kemiska identiteter i selektiva hjärnregioner genom en kombination av CRE-driver möss och CRE-inducerbara AAV-medierad genöverföring. Vidare, fokala uttryck för fotokänsliga opsins som channelrhodopsin 2 (ChR2)20 eller archaerhodopsin (archt)21 kombinerat med ett CRE-loxP eller FLP-FRT-system tillåter oss att manipulera en selektiv neuronala population och specifika neurala väg22.
Vi beskriver här experiment på GABAergic neuroner i BNST som ett exempel. För att uttrycka opsins i en utsedd neuronala population, lämpliga CRE förare möss och CRE-beroende virusvektorer används oftast. Transgena eller Knock-in linjer där opsins uttrycks i synnerhet neuronala populationer är också användbara. I följande experiment använde vi GAD67-CRE Knock-in möss23 där endast GABAergic neuroner uttrycka CRE driver med en C57BL/6j genetisk bakgrund, och en AAV vektor som innehåller ChR2 (hChR2 H134R) smält med eyfp eller eyfp som en kontroll med en “FLEx (Flip-excision) switch”24. Förfarandet beskriver specifikt optogenetisk excitation av GABAergic neuroner i BNST under övervakning av sömn/vakenhet stater25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterade här en metod för att utvärdera effekten av optogenetisk stimulering av nervceller med särskilda kemiska identiteter på statliga övergångar av sömn/vakenhet och gav ett exempel på manipulation av GABABnst nervceller. Våra data visade att optogenetisk excitation av GABABnst nervceller resulterar i omedelbar övergång från NREM sömn till vakenhet.
Olika experimentella konstruktioner finns tillgängliga på grund av utvecklingen av många typer av…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Merck Investigator Studies program (#54843), en KAKENHI Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden, “WillDynamics” (16H06401) (TS), och en KAKENHI Grant-in-Aid för undersökande forskning om innovativa områden (TS) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?. Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. . Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
