Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll, um den Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MicroRNA (MiRNAs) bewerten in Plasma-Proben von Krebspatienten. Insbesondere haben wir einen im Handel erhältlichen Bausatz für zirkulierende MiRNA Extraktion und reversen Transkription verwendet. Zu guter Letzt haben wir eine Gruppe von 24 ausgewählten MiRNAs, die unter Verwendung der benutzerdefinierten Platten in Echtzeit vorab gefleckte Sonde analysiert.
Abstract
Es ist wachsendes Interesse an flüssigen Biopsie für Diagnose, Prognose und therapeutische Begleitung, die Notwendigkeit zuverlässiger und nützlicher Biomarker für die klinische Praxis zu schaffen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu extrahieren, rückwärts zu transkribieren und bewerten die Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MiRNAs aus Plasma-Proben von Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC). Micro-RNAs (MiRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierende RNAs von 18-25 Nukleotide in der Länge, die den Ausdruck der Zielgene translationalen Ebene Regeln und spielen eine wichtige Rolle, einschließlich der Pro und Anti-angiogenen Funktion in die Physiopathologie des verschiedenen Organen. MiRNAs sind stabil in biologischen Flüssigkeiten wie Serum und Plasma, das macht sie ideal zirkulierende Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose und Behandlung Entscheidungen und Überwachung. Zirkulierenden MiRNA Extraktion erfolgte mittels eine schnelle und effektive Methode, die sowohl organische als auch Spalte basierenden Methoden beinhaltet. Für MiRNA Retrotranscription verwendeten wir ein Multi-Schritt-Verfahren, das Polyadenylation auf 3′ und der Ligatur eines Adapters auf 5′ von den Reifen MiRNAs, gefolgt von zufälligen MiRNA Vorverstärkung hält. Wir wählten einen 24-MiRNA benutzerdefinierten Bereich durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) getestet werden und die MiRNA-Sonden auf Array benutzerdefinierter Platten entdeckt. Wir führten qRT-PCR Platte läuft auf einer Echtzeit-PCR-System. Zimmermädchen MiRNAs für Normalisierung wurden ausgewählt, mit GeNorm-Software (v. 3.2). Daten wurden analysiert mit Expression Suite Software (V 1.1) und statistische Analysen wurden durchgeführt. Die Methode erwies sich als zuverlässig und technisch robust sein und könnte nützlich sein, Biomarker Ebenen in flüssigen Proben wie Plasma/Serum oder zu bewerten.
Introduction
CRC ist die dritte Bösartigkeit und die vierte Ursache von Krebs-Todesfälle weltweit am häufigsten diagnostiziert. Bis heute sind Bevacizumab (B), einem monoklonalen Antikörper gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), und (C) Cetuximab oder Panitumumab (P), monoklonale Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), zugelassen First-Line-Behandlung in Kombination mit Chemotherapie (CT)-Regimen.
Mutationen im K-RAS und N-RAS -gen sind die einzige klinisch nützlich Biomarker identifizieren Patienten, die am seltensten zugunsten von Anti-EGFR-basierten CT. Obwohl mehrere Studien sind, zur Suche nach Biomarkern, die vorausschauende Antwort auf B-basierten CT sind durchgeführt worden, gibt es immer noch ein erheblichen Mangel an zuverlässige und wirksame Arzneimittel für den Einsatz in der klinischen Praxis1.
MiRNAs sind kleine RNAs (18-25 Nukleotide in der Länge), die die Übersetzung von Zielgenen regulieren und spielen eine entscheidende Rolle in zahlreichen pathophysiologischen Prozessen, einschließlich der Embryogenese und in der Karzinogenese. Diese Moleküle sind hochstabile in biologischen Flüssigkeiten wie Plasma/Serum, Urin und Speichel, die sie macht, robuste Biomarker für nicht-invasive Probenahme2verwenden. Mit einem Panel von MiRNAs angiogenen Weg beteiligt, wir wollten identifizieren neuer Biomarker zur Vorhersage klinische Ergebnisse bei Patienten mit metastasiertem CRC (mCRC) im Umlauf mit einer B-basierten CT-Therapie behandelt.
Wir analysieren eine Reihe von 52 mCRC Patienten mit B-basierten CT innerhalb der prospektiven multizentrischen randomisierten phase III Studie “italienische Trial in Advanced Colorectal Krebs” (ITACa). Dieses Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt (Comitato Etico Bereich Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Nr. 674) auf 19th September 2007. Alle Patienten gaben Einwilligung vor Blut Musterkollektion. Für jeden Patienten wurden venöse Blutproben vor der Behandlung und bei der ersten klinischen Untersuchung (nach 8 Wochen) gesammelt, um die Basislinie MiRNA Ausdruck und seine Modulation während der Behandlung in Bezug auf Patienten-Outcome zu bewerten.
Durch eine Suche der Literatur ausgewählt wir 21 MiRNAs korreliert mit dem Angiogenese-Prozess, die bekanntermaßen im menschlichen Plasma nachweisbar sind: hat-MiR-107, hat-MiR-126-3 p, hat-MiR-145-5-p, hat-MiR-194-5 p, hat-MiR-199a – 5P, hat-MiR – 200 b – 3p, hat-MiR – 20 b – 5P , hat-MiR-21-5 p, hat-MiR-210-3 p, hat-MiR-221-3 p, hat-MiR-24-3 p, hat-MiR-27a – 3P, hat-MiR – 29 b – 3p, hat-MiR-335-5 p, hat-MiR-424-5 p, hat-MiR-497-5 p, hat-MiR – 520d – 3p, hat-MiR-92a – 3P, hat-MiR-17-5 p und hat-MiR-155-5 p. Auch wir ausgewählt hat-MiR-223-3 p und hat-Mir-484 für endogene Normalisierung3,4,5,6und Cel-MiR-39 von C. Elegans als Spike-in für exogene Normalisierung gereinigt. Alle Daten Normierungen wurden mit 2 ̂ ̄(ΔΔCt) Methode durchgeführt.
Der Nachweis von zirkulierenden MiRNAs präsentiert einige technischen Schwierigkeiten, weil die Moleküle auf einem sehr niedrigen Niveau im Plasma sind und ihre Verstärkung chemisch anspruchsvollen angesichts ihrer kurze Sequenz ist. Aus diesen Gründen haben wir ein Verfahren, das organische Extraktion mit Phenol und einem Glasfaser Spalte basierenden Methodik hält ausgewählt. Zirkulierenden MiRNA-Extraktion ist ein heißes Thema im Bereich der flüssigen Biopsie und eine kommerzielle Kit, das gezeigt hat, zu einem der zuverlässigsten ausgewählt wurden in Bezug auf Menge und Qualität der wiederhergestellten Erträge7,8. Wir haben ein Protokoll zum Umkehren MiRNAs durch das Hinzufügen eines Adapters an 5′ und ein Poly-Tail, 3′ die Reife MiRNA zur Verbesserung der Selektivität und Spezifität der Reaktion zu transkribieren.
Die Robustheit der Methode gegeben, wir entwickelt kundenspezifische Platten mit Pre-gefleckte Sonden für RT-PCR zu jeder Probe in zweifacher Ausfertigung zu beurteilen und 2 Patienten innerhalb jeder Platte analysiert, wie in Abbildung 1dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs (18-25 Nukleotide in der Länge) in der Lage, verbindliche 3′ UTR und Umgebung ihr Ziel Boten-RNA und Hemmung bzw. es erniedrigend. Sie können somit gen Ausdruck Regulierungsbehörden auf der translationalen Ebene betrachtet werden. In den letzten zehn Jahren haben mehrere MiRNAs mit Krebs Initiierung und Entwicklung, so dass sie nützliche klinische Biomarker für die Diagnose, Prognose und Therapie korreliert. Geschützt durch RNases, sind MiRNAs in eine stabile Form in biologi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde teilweise durch Roche s.p.a. und die italienische Agentur für Arzneimittel (AIFA) finanziert.
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
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