खमीर की 4D माइक्रोस्कोपी
Summary
इस प्रोटोकॉल बहु रंग 4 डी (समय चूक 3 डी) confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर नवोदित खमीर में फ्लोरोसेंट लेबल intracellular डिब्बों के विश्लेषण का वर्णन करता है। इमेजिंग पैरामीटर photodamage सीमित करते समय पर्याप्त संकेतों पर कब्जा करने के लिए चुना जाता है. कस्टम ImageJ plugins लेबल संरचनाओं पर नज़र रखी और मात्रात्मक विश्लेषण किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह विशेषता है कि झिल्ली के डिब्बे कैसे बनते हैं और नवोदित खमीर की जीवित कोशिकाओं में बदलना है। खमीर में कई intracellular डिब्बों गतिशील हैं, और उनके गुणों की एक पूरी समझ समय चूक इमेजिंग की आवश्यकता है. बहु रंग 4D confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 5-15 मिनट के एक समय पैमाने पर एक intracellular डिब्बे के व्यवहार और संरचना पर नज़र रखने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. डिब्बे गतिशीलता के कठोर विश्लेषण ऑप्टिकल के हजारों की कब्जा की आवश्यकता है अनुभागों. इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए, photobleaching और phototoxicity बहुत कम लेजर शक्ति पर तेजी से स्कैनिंग से कम कर रहे हैं, और पिक्सेल आयाम और जेड कदम अंतराल सबसे बड़ा मूल्यों है कि पूर्ण संकल्प पर छवि नमूना के साथ संगत कर रहे हैं करने के लिए सेट कर रहे हैं. परिणामस्वरूप 4D डेटा सेट शोर कर रहे हैं, लेकिन deconvolution द्वारा smoothed किया जा सकता है. यहां तक कि उच्च गुणवत्ता वाले डेटा के साथ, विश्लेषण चरण चुनौतीपूर्ण है क्योंकि इंट्रासेल्यूलर संरचनाएं अक्सर कई, विषम, और मोबाइल होती हैं। इस जरूरत को पूरा करने के लिए, कस्टम ImageJ plugins एक कंप्यूटर स्क्रीन पर सरणी 4D डेटा के लिए लिखा गया था, ब्याज की संरचनाओं की पहचान, व्यक्तिगत संरचनाओं को अलग करने के लिए डेटा संपादित करें, फ्लोरोसेंट समय पाठ्यक्रम मात्रा, और अनुमानित की फिल्में बनाने के लिए -stacks. 4D फिल्में विशेष रूप से क्षणिक डिब्बों कि परिपक्वता से अधिक बारी से स्थिर डिब्बों भेद के लिए उपयोगी होते हैं. इस तरह की फिल्मों को भी इस तरह के डिब्बे संलयन के रूप में घटनाओं की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और विशिष्ट उत्परिवर्तनों या अन्य क्षोभ के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए.
Introduction
एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम के कंपार्टमेंट्स लगातार फ्रलक्स में होते हैं, और उनकी पूर्ण विशेषता को लाइव सेल इमेजिंग की आवश्यकता होती है। यहाँ वर्णित एक प्रोटोकॉल है कि रोजगार 4D (समय चूक 3 डी) confocal माइक्रोस्कोपी नवोदित खमीर में फ्लोरोसेंट लेबल डिब्बों कल्पना है. इस विधि को पिकिया पासारिस और सकहोमोमिक्स सेरेविसे1,2,3में स्रावी डिब्बों की गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए विकसित किया गया था . इस प्रोटोकॉल एस सेरेविसियाई पर केंद्रित है, जिसमें एक nonstacked Golgi है जिसमें व्यक्तिगत कुंडी ऑप्टिकली resolvable4हैं. एस सेरेविएसिया में असामान्य Golgi संगठन 4D माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदर्शन सक्षम है कि एक Golgi cisterna शुरू में निवासी जल्दी Golgi प्रोटीन के साथ लेबल, और फिर उन प्रोटीन खो देता है, जबकि निवासी देर Golgi प्रोटीनप्राप्त 3 ,5. इस संक्रमण एक तनाव है जिसमें जल्दी Golgi प्रोटीन Vrg4 GFP के साथ लेबल है, जबकि देर Golgi प्रोटीन Sec7 एक monomeric लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल है बनाने के द्वारा कल्पना की जा सकती है. जब अलग-अलग कुंडों को ट्रैक किया जाता है, तो परिपक्वता को हरे-से-लाल रूपांतरण3के रूप में देखा जाता है। विश्लेषण के इस प्रकार प्रोटीन स्थानीयकरण और डिब्बे पहचान के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, थोड़ा ऑफसेट आगमन और प्रस्थान समय के साथ दो प्रोटीन कभी कभी स्थिर छवियों में विभिन्न डिब्बों लेबल प्रकट हो सकता है, लेकिन 4D फिल्मों में देखा जा सकता है अलग अलग समय अंक6,7 पर एक ही डिब्बे लेबल . इस प्रकार, 4D माइक्रोस्कोपी घटना है कि अन्यथा स्पष्ट नहीं होगा पता चलता है.
खमीर डिब्बों की जानकारीपूर्ण 4D माइक्रोस्कोपी उचित प्रक्रियाओं और उपकरण2के साथ प्राप्त किया जा सकता है। जब भी संभव हो, फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैगिंग जीन प्रतिस्थापन8 द्वारा किया जाता है overexpression कलाकृतियों से बचने के लिए. क्योंकि intracellular संरचनाओं अक्सर बहुत गतिशील हैं, 4D इमेजिंग सुनिश्चित करें कि एक संरचना समय के साथ मज़बूती से ट्रैक किया जाता है की जरूरत है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल उच्च संवेदनशीलता डिटेक्टरों से लैस एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप कार्यरत हैं. इस डिवाइस के साथ, एस cerevisiae की पूरी सेल मात्रा confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा लगभग हर 1-3 s द्वारा छवि बनाई जा सकती है, 2 s अंतराल के साथ विशिष्ट जा रहा है. फ्लोरोफोर्स के लेबलिंग घनत्व और उनके फोटोफिजिकल गुणों के आधार पर 5-15 मिनट तक डेटा एकत्र किया जा सकता है। मुख्य बाधा photobleaching को कम करने के लिए है। इस उद्देश्य के लिए, लेजर तीव्रता के रूप में संभव के रूप में कम रखा जाता है, confocal स्कैन गति अधिकतम है, और ऑप्टिकल पैरामीटर के लिए प्रासंगिक जानकारी पर कब्जा करने के क्रम में NyQuist सीमा पर छवि के लिए कॉन्फ़िगर कर रहे हैं, जबकि अत्यधिक प्रकाश जोखिम से परहेज. इन सेटिंग्स को भी phototoxicity को कम करने की उम्मीद कर रहे हैं, एक कारक है कि अक्सर लाइव सेल इमेजिंग9,10,11 केदौरान अनदेखी की है . परिणामस्वरूप शोर डेटा ब्लीच सुधार और deconvolution एल्गोरिदम के साथ संसाधित कर रहे हैं फ्लोरोसेंट तीव्रता के परिमाण की सुविधा के लिए.
यहां तक कि उच्च गुणवत्ता 4D फिल्मों के साथ, विश्लेषण मुश्किल है क्योंकि खमीर डिब्बों के लिए कई हो जाते हैं, विषम, और मोबाइल. confocal माइक्रोस्कोपी की आंतरिक सीमाओं और लंबे समय तक 4D इमेजिंग के लिए आवश्यक गैर इष्टतम सेटिंग्स के कारण, फ्लोरोसेंट संरचनाओं है कि एक दूसरे के पास हैं हल करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. इस समस्या को फ्लोरोसेंट संरचनाओं की छोटी संख्या पर ध्यान केंद्रित करके दरकिनार किया जा सकता है जो लेबलिंग अवधि की अवधि के लिए ऑप्टिकली समाधान योग्य रहते हैं, इस धारणा के साथ कि उन संरचनाओं लेबल की पूरी आबादी के प्रतिनिधि हैं डिब्बों. फ्लोरिसेंट डिब्बों कि मज़बूती से ट्रैक किया जा सकता है प्रक्षेपित की फिल्मों को देखने के द्वारा की पहचान कर रहे हैं – stacks और montages की एक श्रृंखला है जिसमें प्रत्येक समय बिंदु के लिए ऑप्टिकल वर्गों एक कंप्यूटर स्क्रीन पर arrayed हैं बनाने के द्वारा. इस विश्लेषण कस्टम ImageJ12 plugins है, जो एक व्यक्तिगत संरचना अलगाव में ट्रैक किया जा करने की अनुमति कार्यरत हैं.
हाल के तरीकों के कागजात खमीर13 में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग के साथ ही सिद्धांत और खमीर कोशिकाओं के 4D confocal इमेजिंग के अभ्यास को कवरकिया 2. इस प्रोटोकॉल एक 4D इमेजिंग प्रयोग के प्रमुख व्यावहारिक पहलुओं पर केंद्रित है. यह पहले से वर्णित प्रक्रियाओं, साथ ही ImageJ प्लगइन कोड और प्रलेखन के अद्यतन संस्करणों के लिए कुछ एन्हांसमेंट्स शामिल हैं. दिखाया उदाहरण Golgi गतिशीलता पर केंद्रित है, लेकिन इस प्रोटोकॉल अन्य खमीर डिब्बों इमेजिंग के लिए समान रूप से उपयुक्त है.
Protocol
Representative Results
Discussion
खमीर organelles के 4D confocal इमेजिंग कई मापदंडों के सावधान ट्यूनिंग की आवश्यकता है। प्रमुख चिंता photobleaching और phototoxicity है. एक ठेठ 4D फिल्म ऑप्टिकल वर्गों के हजारों इकट्ठा शामिल है, तो लेजर रोशनी के रूप में संभव के रूप में कम ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम NIH अनुदान R01 GM104010 द्वारा समर्थित किया गया था. एकीकृत माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा है, जो NIH वित्त पोषित कैंसर केंद्र सहायता अनुदान P30 CA014599 द्वारा समर्थित है पर Vytas Bindokas और क्रिस्टीन Labno को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए धन्यवाद.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
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