4D مجهرية الخميرة
Summary
يصف هذا البروتوكول تحليل المقصورات داخل الخلايا التي تحمل علامة الفلورسنت في الخميرة الناشئة باستخدام مجهرية متعددة الألوان 4D (الفاصل الزمني 3D). يتم اختيار معلمات التصوير لالتقاط إشارات كافية مع الحد من الأضرار الضوئية. تسمح الإضافات المخصصة لـ ImageJ بتتبع الهياكل المسماة وتحليلها كمياً.
Abstract
الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد كيفية تشكيل مقصورات الغشاء وتحويلها في الخلايا الحية من الخميرة الناشئة. العديد من المقصورات داخل الخلايا في الخميرة ديناميكية، وفهم كامل لخصائصها يتطلب التصوير بفاصل زمني. مجهري الفلورية البؤرية ثنائية الجوانب متعددة الألوان هي طريقة قوية لتتبع سلوك وتكوين المقصورة داخل الخلايا على مقياس زمني من 5-15 دقيقة. المقاطع. ولتحقيق هذا الهدف، يتم تقليل ابيضاض الصور والسمية الضوئية عن طريق المسح الضوئي بسرعة بقوة ليزر منخفضة جداً، ويتم تعيين أبعاد البكسل والفواصل الزمنية لخطوات Z إلى أكبر القيم المتوافقة مع أخذ عينات من الصورة بدقة كاملة. مجموعات البيانات 4D الناتجة صاخبة ولكن يمكن تمهيدها عن طريق deconvolution. حتى مع بيانات عالية الجودة، فإن مرحلة التحليل صعبة لأن الهياكل داخل الخلايا غالباً ما تكون عديدة وغير متجانسة ومتحركة. لتلبية هذه الحاجة، تمت كتابة الإضافات ImageJ المخصصة إلى مجموعة البيانات 4D على شاشة الكمبيوتر، وتحديد الهياكل ذات الأهمية، تحرير البيانات لعزل الهياكل الفردية، وقياس الدورات الزمنية الفلورة، وجعل الأفلام من مكدسات Z المتوقعة. الأفلام 4D مفيدة بشكل خاص للتمييز بين مقصورات مستقرة من مقصورات عابرة التي تتحول عن طريق النضج. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الأفلام لوصف أحداث مثل الانصهار مقصورة، واختبار آثار طفرات محددة أو اضطرابات أخرى.
Introduction
مقصورات نظام الغشاء الداخلي في تدفق مستمر، وتوصيفها الكامل يتطلب التصوير بالخلايا الحية. يوصف هنا هو البروتوكول الذي يستخدم 4D (الفاصل الزمني 3D) مجهرية البؤرة لتصور المقصورات وصفت الفلورسنت في الخمائر الناشئة. وقد وضعت هذه الطريقة لتتبع ديناميات المقصورات السرية في Pichia pastoris وSaccharomyces cerevisiae1،2،3. يركز هذا البروتوكول على S. cerevisiaه، الذي يحتوي على غولجي غير مكدسة التي cisternae الفردية هي قابلة للحل بصريا4. منظمة غولجي غير عادية في S. cerevisiae تمكين مظاهرة عن طريق الفحص المجهري 4D أن تفيجبالا غولجي تسميات في البداية مع البروتينات غولجي المقيمة في وقت مبكر، ومن ثم يفقد تلك البروتينات في حين الحصول على البروتينات غولجي المقيمة في وقت متأخر3 ،5. ويمكن تصور هذا الانتقال عن طريق خلق سلالة التي يتم تسمية البروتين غولجي في وقت مبكر Vrg4 مع GFP في حين يتم تسمية البروتين غولجي في وقت متأخر Sec7 مع بروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي. عندما يتم تعقب التصهريج الفردية، ويلاحظ النضج كتحويل الأخضر إلى الأحمر3. هذا النوع من التحليل يمكن أن توفر معلومات قيمة حول توطين البروتين وهوية المقصورة. على سبيل المثال، قد يظهر بروتينان مع إزاحة طفيفة لأوقات الوصول والمغادرة في بعض الأحيان لتسمية مقصورات مختلفة في صور ثابتة، ولكن يمكن رؤيتها في أفلام 4D لتسمية نفس المقصورة في نقاط زمنية مختلفة6،7 . وهكذا، يكشف الفحص المجهري 4D الظواهر التي لن تكون واضحة خلاف ذلك.
يمكن تحقيق مجهرية 4D مفيدة من مقصوراتالخميرة مع الإجراءات المناسبة والمعدات 2. كلما كان ذلك ممكنا، يتم وضع العلامات البروتين الفلورسنت عن طريق استبدال الجينات8 لتجنب القطع الأثرية الإفراط في التعبير. نظرًا لأن الهياكل داخل الخلايا غالبًا ما تكون ديناميكية جدًا، فهناك حاجة إلى التصوير ثلاثي الأبعاد لضمان تتبع البنية بشكل موثوق مع مرور الوقت. البروتوكول الموصوف هنا يستخدم مجهر ضوئي ضوئي مسح بالليزر مجهز بكاشفات حساسية عالية. مع هذا الجهاز، يمكن تصوير حجم الخلية بالكامل من S. cerevisiae عن طريق الفحص المجهري البؤري تقريبا كل 1-3 ق، مع فترات 2 ق يجري نموذجية. يمكن جمع البيانات لمدة تصل إلى 5-15 دقيقة اعتمادا على كثافات وضع العلامات من الفلوروفوريس وخصائصها البيوفيزيائية الضوئية. العقبة الرئيسية هي تقليل تبييض الصور. ولهذا الغرض، يتم الاحتفاظ بكثافة الليزر في أدنى مستوى ممكن، وتُزيد سرعة المسح الضوئي البؤري إلى أقصى حد، وتُمكَّن المعلمات البصرية للصورة عند حد Nyquist من أجل التقاط المعلومات ذات الصلة مع تجنب التعرض المفرط للضوء. ومن المتوقع أيضا أن تخفف هذه الإعدادات من السمية الضوئية، وهو عامل غالبا ما يتم تجاهله أثناء تصوير الخلايا الحية9و10و11. تتم معالجة البيانات الصاخبة الناتجة عن ذلك مع تصحيح التبييض وخوارزميات التناقص لتسهيل القياس الكمي لكثافة الفلورة.
حتى مع أفلام 4D عالية الجودة، والتحليل صعب لأن مقصورات الخميرة تميل إلى أن تكون عديدة، غير متجانسة، والمحمول. نظرًا للقيود الجوهرية للتنظير المجهري البؤري والإعدادات غير المثلى المطلوبة للتصوير ثلاثي الأبعاد لفترات طويلة، يصعب حل هياكل الفلورسنت القريبة من بعضها البعض. ويمكن التحايل على هذه المشكلة من خلال التركيز على عدد قليل من الهياكل الفلورية التي لا تزال قابلة للحل بصريا لمدة فترة وضع العلامات، مع افتراض أن تلك الهياكل تمثل جميع السكان من المسمى المقصورات. يتم تحديد مقصورات الفلورسنت التي يمكن تعقبها بشكل موثوق عن طريق عرض الأفلام من مكدسات Z المتوقعة وعن طريق إنشاء سلسلة من المونتاج الذي يتم تجميع المقاطع البصرية لكل نقطة زمنية على شاشة الكمبيوتر. يستخدم هذا التحليل الإضافات المخصصة ImageJ12، والتي تسمح بتتبع بنية فردية في عزلة.
أوراق الأساليب الأخيرة غطت استخدام البروتينات الفلورية في الخميرة13 وكذلك نظرية وممارسة التصوير البؤري 4D من خلايا الخميرة2. يركز هذا البروتوكول على الجوانب العملية الرئيسية لتجربة التصوير رباعية الأبعاد. وهو يتضمن بعض التحسينات على الإجراءات الموصوفة سابقا، فضلا عن الإصدارات المحدثة من رمز البرنامج المساعد ImageJ والوثائق. المثال المعروض يركز على ديناميات غولجي، ولكن هذا البروتوكول هو على قدم المساواة مناسبة لتصوير مقصورات الخميرة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
4D التصوير البؤري من العضيات الخميرة يتطلب ضبط دقيق من المعلمات متعددة. والشاغل الرئيسي هو ابيضاض الصور والسمية الضوئية. فيلم 4D نموذجي ينطوي على جمع الآلاف من المقاطع البصرية، لذلك يجب أن تبقى الإضاءة الليزر منخفضة قدر الإمكان. جنبا إلى جنب يمكن استخدام علامات البروتين الفلورسنت لتعزيز ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحة R01 GM104010. شكرا للمساعدة في التنظير المجهري الفلوري لفيتاس بيندوكاس وكريستين لابنو في المرفق الأساسي للميكروسكوب المتكامل، الذي تدعمه منحة دعم مركز السرطان التي تمولها المعاهد القومية للصحة P30 CA014599.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
- Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
- Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
- Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
- Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
- Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
- Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
- Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
- Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
- Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).
- Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
- Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
- Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
- Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).
- Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , (2019).
