酵母の4D顕微鏡検査
Summary
このプロトコルは、多色4D(タイムラプス3D)共焦点顕微鏡を用いた発芽酵母における蛍光標識細胞内コンパートメントの分析について説明する。イメージ投射パラメータは、光の損傷を制限しながら、適切な信号をキャプチャするために選択されます。カスタム ImageJ プラグインを使用すると、ラベル付き構造体を追跡し、定量的に分析できます。
Abstract
このプロトコルの目的は、発芽酵母の生細胞における膜コンパートメントの形成と形質転換を特徴付けることを特徴付ける。酵母の多くの細胞内コンパートメントは動的であり、その特性を完全に理解するには、タイムラプスイメージングが必要です。マルチカラー4D共焦点蛍光顕微鏡は、5-15分の時間スケールで細胞内コンパートメントの挙動と組成を追跡するための強力な方法です。セクション。この目的を達成するために、光漂白と光毒性は非常に低いレーザーパワーで急速にスキャンすることによって最小化され、ピクセルの次元およびZステップ間隔はフル解像度でイメージをサンプリングすることと互換性がある最も大きい値に設定される。結果として得られる 4D データ セットはノイズが多いですが、デコンボリューションによってスムージングできます。質の高いデータであっても、細胞内構造は多く、異種的で、移動性が高いため、分析段階は困難です。このニーズを満たすために、カスタムImageJプラグインは、コンピュータ画面上のアレイ4Dデータに書き込まれ、対象の構造を特定し、個々の構造を分離するためにデータを編集し、蛍光時間コースを定量化し、投影されたZスタックのムービーを作りました。4D ムービーは、成熟によってひっくり返る一時的なコンパートメントと安定したコンパートメントを区別する場合に特に便利です。このようなムービーは、コンパートメント融合などのイベントを特徴付けたり、特定の突然変異やその他の摂動の影響をテストするためにも使用できます。
Introduction
エンドメンブレンシステムのコンパートメントは一定のフラックスにあり、その完全な特性は生細胞イメージングを必要とします。ここでは、4D(タイムラプス3D)共焦点顕微鏡を用いて、発芽酵母の蛍光標識されたコンパートメントを可視化するプロトコルを説明します。この方法は、ピチア・パスマティスとサッカロマイセス・セレビシエ1、2、3の分泌コンパートメントのダイナミクスを追跡するために開発された。このプロトコルは、個々のシスターナが光学的に溶解可能である非積層ゴルジを有するS.セレビシアeに焦点を当てています。S.セレビシエの珍しいゴルジ組織は、ゴルジ・シスターナが最初に常駐初期ゴルジタンパク質とラベルを付け、その後、常駐後期ゴルジタンパク質を獲得しながら、それらのタンパク質を失う4D顕微鏡によるデモンストレーションを可能にしました3 、5.この遷移は、初期のゴルジタンパク質Vrg4がGFPで標識され、後期ゴルジタンパク質Sec7が単光赤色蛍光タンパク質で標識される歪みを作り出すことによって可視化することができる。個々のシスターナを追跡すると、成熟は緑から赤への変換3として観察される。このタイプの分析は、タンパク質の局在化とコンパートメントの同一性に関する貴重な情報を提供できます。たとえば、到着時刻と出発時刻をわずかにオフセットした 2 つのタンパク質は、静止画像で異なるコンパートメントにラベルを付ける場合がありますが、4D ムービーでは、異なる時点 6、 7 で同じコンパートメントにラベルを付けることができます。.したがって、4D顕微鏡検査は、そうでなければ明らかではない現象を明らかにする。
酵母コンパートメントの有益な4D顕微鏡検査は、適切な手順と機器2で達成することができます。可能な限り、蛍光タンパク質タグは、過剰発現アーティファクトを回避するために遺伝子置換8によって行われる。細胞内構造は非常に動的であることが多いため、時間の経過と同時に構造を確実に追跡するためには、4Dイメージングが必要です。ここで説明するプロトコルは、高感度検出器を備えたレーザー走査共焦点顕微鏡を採用しています。この装置によって、S.cerevisiaeの全細胞容積は、2つのs間隔が典型的である、ほぼ1〜3秒ごとに共焦点顕微鏡によってイメージ化することができる。データは、蛍光体の標識密度とその光物理学的特性に応じて、最大5〜15分間収集することができます。主なハードルは、光漂白を最小限に抑えることです。この目的のために、レーザー強度を可能な限り低く保ち、共焦点スキャン速度を最大化し、光学パラメータは、過度の光暴露を避けながら関連情報をキャプチャするためにナイキスト限界で画像するように構成されています。これらの設定はまた、光毒性を緩和することが期待され、生細胞イメージング9、10、11の間にしばしば見落とされる要因である。得られた騒々しいデータは、蛍光強度の定量を容易にするために漂白剤補正および破壊アルゴリズムで処理されます。
高品質の 4D ムービーでも、酵母コンパートメントは多数、異機種混在、およびモバイルである傾向があるため、分析は難しくなります。共焦点顕微鏡検査の本質的な制限と、長時間の4Dイメージングに必要な非最適な設定のために、互いに近い蛍光構造を解決することは困難です。この問題は、標識期間中に光学的に溶解可能な少数の蛍光構造に焦点を当てることで回避できる。コンパートメント。確実に追跡できる蛍光コンパートメントは、投影されたZスタックのムービーを見て、各時間ポイントの光学セクションがコンピュータ画面上に配列される一連のモンタージュを作成することによって識別されます。この分析では、カスタム ImageJ12プラグインを使用して、個々の構造を単独で追跡できます。
最近の方法論文は、酵母13における蛍光タンパク質の使用ならびに酵母細胞2の4D共焦点イメージングの理論および実践をカバーした。このプロトコルは、4Dイメージング実験の主要な実用的な側面に焦点を当てています。これには、前述のプロシージャに対するいくつかの機能強化と、ImageJ プラグイン コードとドキュメントの更新されたバージョンが含まれています。示されている例はゴルジダイナミクスに焦点を当てていますが、このプロトコルは他の酵母コンパートメントのイメージングにも同様に適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
酵母オルガネラの4D共焦点イメージングは、複数のパラメータの慎重なチューニングを必要とします。主な懸念は、光漂白と光毒性です。一般的な 4D ムービーでは、何千もの光学セクションを収集する必要があるため、レーザー照明はできるだけ低く抑える必要があります。タンパク質蛍光タンパク質タグは、タグ付けされたタンパク質16、17の発?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH助成金R01 GM104010によってサポートされました。NIHが出資するがんセンターサポートグラントP30 CA014599が支援する統合顕微鏡コア施設で、Vytas Bindokasとクリスティン・ラボノへの蛍光顕微鏡検査の支援をありがとうございます。
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
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