Microscopía 4D de levadura
Summary
Este protocolo describe el análisis de compartimentos intracelulares etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes utilizando microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) multicolor. Los parámetros de imagen se eligen para capturar señales adecuadas mientras se limitan los fotodaños. Los plugins Personalizados ImageJ permiten rastrear y analizar cuantitativamente las estructuras etiquetadas.
Abstract
El objetivo de este protocolo es caracterizar cómo se forman y transforman los compartimentos de membrana en células vivas de levadura en ciernes. Muchos compartimentos intracelulares en la levadura son dinámicos, y una comprensión completa de sus propiedades requiere imágenes de lapso de tiempo. La microscopía de fluorescencia confocal 4D multicolor es un método potente para rastrear el comportamiento y la composición de un compartimiento intracelular en una escala de tiempo de 5-15 min. El análisis riguroso de la dinámica del compartimiento requiere la captura de miles de Secciones. Para lograr este objetivo, el fotoblanqueo y la fototoxicidad se minimizan escaneando rápidamente a muy baja potencia láser, y las dimensiones en píxeles y los intervalos de paso en Z se establecen en los valores más grandes que son compatibles con el muestreo de la imagen a resolución completa. Los conjuntos de datos 4D resultantes son ruidosos, pero se pueden suavizar mediante la desconvolución. Incluso con datos de alta calidad, la fase de análisis es difícil porque las estructuras intracelulares son a menudo numerosas, heterogéneas y móviles. Para satisfacer esta necesidad, los plugins personalizados de ImageJ se escribieron en datos 4D de matriz en una pantalla de computadora, identificar estructuras de interés, editar los datos para aislar estructuras individuales, cuantificar los cursos de tiempo de fluorescencia y hacer películas de las pilas Z proyectadas. Las películas 4D son particularmente útiles para distinguir compartimentos estables de compartimentos transitorios que se vuelcan por maduración. Estas películas también se pueden utilizar para caracterizar eventos como la fusión de compartimentos, y para probar los efectos de mutaciones específicas u otras perturbaciones.
Introduction
Los compartimentos del sistema de endomembrana están en flujo constante, y su caracterización completa requiere imágenes celulares vivas. Aquí se describe un protocolo que emplea la microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) para visualizar compartimentos etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes. El método fue desarrollado para rastrear la dinámica de los compartimentos secretores en Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Este protocolo se centra en S. cerevisiae, que tiene un Golgi no apilado en el que las cisternae individuales son ópticamente resolubles4. La inusual organización Golgi en S. cerevisiae permitió la demostración por microscopía 4D que una Golgi cisterna etiqueta inicialmente con proteínas Golgi tempranas residentes, y luego pierde esas proteínas mientras adquiere proteínas Golgi tardías residentes3 ,5. Esta transición se puede visualizar mediante la creación de una cepa en la que la proteína Golgi vrg4 temprano está etiquetada con GFP, mientras que la proteína Golgi tardía Sec7 está etiquetada con una proteína fluorescente roja monomérica. Cuando se realiza un seguimiento de cisternae individuales, se observa la maduración como una conversión de verde a rojo3. Este tipo de análisis puede proporcionar información valiosa sobre la localización de proteínas y la identidad del compartimiento. Por ejemplo, dos proteínas con tiempos de llegada y salida ligeramente compensados a veces pueden parecer etiquetar diferentes compartimentos en imágenes estáticas, pero se pueden ver en películas 4D para etiquetar el mismo compartimento en diferentes puntos de tiempo6,7 . Por lo tanto, la microscopía 4D revela fenómenos que de otra manera no serían evidentes.
La microscopía 4D informativa de los compartimentos delevadura se puede lograr con los procedimientos y equipos adecuados 2. Siempre que sea posible, el etiquetado de proteínas fluorescentes se realiza mediante reemplazo genético8 para evitar artefactos de sobreexpresión. Debido a que las estructuras intracelulares son a menudo muy dinámicas, se necesitan imágenes 4D para garantizar que una estructura se rastree de forma fiable a lo largo del tiempo. El protocolo descrito aquí emplea un microscopio confocal de escaneo láser equipado con detectores de alta sensibilidad. Con este dispositivo, todo el volumen celular de S. cerevisiae se puede escanear mediante microscopía confocal aproximadamente cada 1-3 s, con intervalos de 2 s siendo típicos. Los datos se pueden recopilar durante un máximo de 5-15 minutos dependiendo de las densidades de etiquetado de los fluoróforos y sus propiedades fotofísicas. El principal obstáculo es minimizar el fotoblanqueo. Para ello, las intensidades láser se mantienen lo más bajas posible, se maximiza la velocidad de escaneo confocal y los parámetros ópticos se configuran para crear imágenes en el límite de Nyquist con el fin de capturar la información relevante evitando una exposición excesiva a la luz. Estos ajustes también se espera que alivien la fototoxicidad,un factor que a menudo se pasa por alto durante las imágenes de células vivas 9,10,11. Los datos de ruidoso resultantes se procesan con algoritmos de corrección de lejía y desconvolución para facilitar la cuantificación de las intensidades de fluorescencia.
Incluso con películas 4D de alta calidad, el análisis es complicado porque los compartimentos de levadura tienden a ser numerosos, heterogéneos y móviles. Debido a las limitaciones intrínsecas de la microscopía confocal y los ajustes no óptimos necesarios para la toma de imágenes 4D prolongada, las estructuras fluorescentes que están cerca unas de otras son difíciles de resolver. Este problema puede eludirse centrándose en el pequeño número de estructuras fluorescentes que permanecen fijamente resueltas ópticamente durante el período de etiquetado, suponiendo que esas estructuras son representativas de toda la población de Compartimientos. Los compartimentos fluorescentes que se pueden rastrear de forma fiable se identifican mediante la visualización de películas de pilas Z proyectadas y mediante la creación de una serie de montajes en los que las secciones ópticas para cada punto de tiempo se agrupan en una pantalla de ordenador. Este análisis emplea plugins personalizados de ImageJ12, que permiten realizar un seguimiento de una estructura individual de forma aislada.
Los documentos de métodos recientes cubrieron el uso de proteínas fluorescentes en la levadura13, así como la teoría y práctica de la imagen confocal 4D de células de levadura2. Este protocolo se centra en los aspectos prácticos clave de un experimento de imágenes 4D. Incluye algunas mejoras a los procedimientos descritos anteriormente, así como versiones actualizadas del código y documentación del plugin ImageJ. El ejemplo mostrado se centra en la dinámica de Golgi, pero este protocolo es igualmente adecuado para la toma de imágenes de otros compartimentos de levadura.
Protocol
Representative Results
Discussion
La toma de imágenes confocales 4D de los orgánulos de levadura requiere una afinación cuidadosa de múltiples parámetros. La principal preocupación es el fotoblanqueo y la fototoxicidad. Una película 4D típica implica la recopilación de miles de secciones ópticas, por lo que la iluminación láser debe mantenerse lo más baja posible. Las etiquetas de proteínas fluorescentes tándem se pueden utilizar para aumentar la señal sin aumentar la expresión de la proteína etiquetada16,</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01 GM104010. Gracias por la ayuda con la microscopía de fluorescencia a Vytas Bindokas y Christine Labno en Integrated Microscopy Core Facility, que cuenta con el apoyo de la subvención de apoyo a cancercenteros P30 CA014599, financiada por NIH.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
- Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
- Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
- Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
- Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
- Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
- Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
- Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
- Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
- Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).
- Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
- Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
- Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
- Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).
- Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , (2019).
