酵母的4D显微镜
Summary
该协议描述了使用多色4D(延时3D)共聚焦显微镜对萌芽酵母中荧光标记细胞内腔的分析。选择成像参数是为了捕捉足够的信号,同时限制光损伤。自定义 ImageJ 插件允许跟踪和定量分析标记的结构。
Abstract
该协议的目的是描述膜腔在萌芽酵母的活细胞中如何形成和转化。酵母中的许多细胞内腔是动态的,要充分了解其特性,需要延时成像。多色 4D 共聚焦荧光显微镜是一种强大的方法来跟踪细胞内隔间的行为和组成,时间尺度为 5-15 分钟。 严格分析隔间动力学需要捕获数千个光学部分。为了实现这一目标,光漂白和光毒性通过以极低的激光功率快速扫描而最小化,像素尺寸和 Z 步长间隔设置为与全分辨率采样图像兼容的最大值。生成的 4D 数据集是嘈杂的,但可以通过反卷积来平滑。即使使用高质量的数据,分析阶段也极具挑战性,因为细胞内结构通常数量众多、异构且具有流动性。为了满足这一需求,将自定义 ImageJ 插件写入计算机屏幕上的阵列 4D 数据、识别感兴趣的结构、编辑数据以隔离单个结构、量化荧光时间课程以及制作投影 Z 堆栈的影片。4D 电影特别适用于区分稳定隔间与通过成熟而翻过来的瞬态隔间。此类电影还可用于描述诸如隔间融合等事件,并测试特定突变或其他扰动的影响。
Introduction
内膜系统的隔间在不断变化,其完整的表征需要活细胞成像。此处描述的是使用 4D(延时 3D)共聚焦显微镜来可视化萌芽酵母中荧光标记的隔间的协议。该方法被开发来跟踪皮基亚牧师和萨查莫西斯塞雷维西亚1,2,3的分泌隔间的动态。该协议侧重于S.cerevisiae,它有一个非堆叠的Golgi,其中单个蓄水池是光学上可解析的4。S.cerevisiae的不寻常的戈尔吉组织通过 4D 显微镜演示了 Golgi csterna 最初与居民早期戈尔吉蛋白贴标签,然后在获取居民晚期戈尔吉蛋白 3 时丢失这些蛋白质 , 5.这种过渡可以通过创建一个菌株来可视化,其中早期的Golgi蛋白Vrg4被标记为GFP,而晚期的Golgi蛋白Sec7则标有单体红色荧光蛋白。当跟踪单个蓄水池时,成熟被观察为绿色到红色转换3。这种类型的分析可以提供有关蛋白质定位和隔间标识的宝贵信息。例如,两种稍微偏移到达和离开时间的蛋白质有时在静态图像中可能显示标记不同的隔间,但在 4D 电影中可以看到,可以在不同时间点6、7 标记同一隔间.因此,4D 显微镜揭示了其他不明显的现象。
酵母舱的信息4D显微镜可以通过适当的程序和设备2实现。只要有可能,荧光蛋白标记通过基因替换8执行,以避免过度表达伪影。由于细胞内结构通常非常动态,因此需要 4D 成像,以确保随着时间的推移可靠地跟踪结构。此处描述的协议采用激光扫描共聚焦显微镜,配备高灵敏度探测器。使用此装置,S.cerevisae的整个细胞体积大约每 1-3 秒可通过共聚焦显微镜成像,通常为 2 秒间隔。根据荧光水光水线的标签密度及其光物理特性,可以收集长达 5-15 分钟的数据。主要障碍是尽量减少光漂白。为此,激光强度尽可能低,共聚焦扫描速度最大化,光学参数配置为在奈奎斯特极限下成像,以便捕获相关信息,同时避免过度的光线照射。这些设置也有望减轻光毒性,在活细胞成像9,10,11中经常被忽视的因素。由此产生的噪声数据使用漂白剂校正和去卷积算法进行处理,以促进荧光强度的量化。
即使使用高质量的 4D 电影,分析也十分棘手,因为酵母隔间往往数量众多、异构且可移动。由于共聚焦显微镜的内在局限性以及长时间 4D 成像所需的非最佳设置,彼此接近的荧光结构难以解析。这个问题可以通过关注在标签期间保持光学可解的少量荧光结构来规避,并假定这些结构代表标签的全体人群车厢。通过观看投影 Z 堆栈的影片和创建一系列蒙太奇,将每个时间点的光学部分排列在计算机屏幕上,可以可靠地跟踪的荧光隔间可以识别。此分析采用自定义 ImageJ12插件,允许单独跟踪单个结构。
最近的方法论文涵盖了荧光蛋白在酵母13中的使用,以及酵母细胞2的4D共聚焦成像的理论与实践。该协议侧重于 4D 成像实验的关键实际方面。它包括以前描述的过程的一些增强功能,以及 ImageJ 插件代码和文档的更新版本。所示示例侧重于 Golgi 动力学,但此协议同样适用于成像其他酵母腔。
Protocol
Representative Results
Discussion
酵母细胞器的4D共聚焦成像需要仔细调整多个参数。主要问题是光漂白和光毒性。典型的 4D 影片涉及收集数千个光学部分,因此激光照明必须保持在尽可能低的位。串联荧光蛋白标记可用于增强信号,而不会增加标记蛋白16、17的表达。最大化扫描速度有助于限制光损伤,还允许在适当的短间隔内捕获 Z 堆栈。在XY和Z中,在奈奎斯特极限处的体素尺寸最小化了…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH赠款R01 GM104010的支持。感谢在综合显微镜核心设施为Vytas Bindokas和Christine Labno提供荧光显微镜帮助,该设施由NIH资助的癌症中心支持赠款P30 CA014599提供支持。
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
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