Article de méthode

Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

DOI :

10.3791/58621

⸱

7 janvier 2019

 ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, School of Medicine, 2Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans le foie, les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte et leur fonction décrite consiste à éliminer le liquide interstitiel du foie vers les ganglions lymphatiques où les débris cellulaires et les antigènes peuvent être interrogés. Nous sommes très désireux de comprendre comment le système vasculaire lymphatique peut-être être impliqué dans l’inflammation et la fonction des cellules immunitaires dans le foie. Cependant, très peu a été publié d’établir des protocoles de digestion pour l’isolement des cellules endothéliales lymphatiques (ESL) du foie ou des marqueurs spécifiques qui peuvent servir à évaluer le foie ESL sur une base par cellule. Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour la digestion et du foie de coloration afin d’évaluer la population de l’ESL dans le foie. Nous sommes convaincus que la méthode décrite ici vous sera utile pour l’identification et l’isolement des ESL le foie et permettra de renforcer notre compréhension de comment ESL répondent au microenvironnement du foie.

Introduction

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Le rôle des vaisseaux lymphatiques et les ESL dans le foie n’est pas bien compris. Alors que les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte du foie1 et augmentent au cours de la maladie2, très peu est entendu au sujet de la fonction et du phénotype des ESL dans le foie. Avec la découverte de marqueurs que l'on trouve principalement sur ESL3, l’importance de ces cellules à l’intérieur des niches de différents tissus dans l’homéostasie et la maladie comblera une lacune importante dans notre compréhension. ESL ont un rôle majeur dans le maintien de la tolérance périphérique dans le ganglion lymphatique et dans des tumeurs métastatiques en interagissant directement avec les cellules des T4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ESL dans le ganglion lymphatique peut favoriser l’immunité protectrice par l’intermédiaire de leurs interactions avec les cellules dendritiques migrateurs14,15,16. Par conséquent, il y a des rôles multiples pour les ESL qui peut-être être spécifiques à des tissus et des interactions dans lesquelles ils sont présents. Toutefois, très peu est comprise sur ESL l’interaction avec les cellules immunitaires dans les tissus ou le fonctionnement des ESL dans différents organes ; ainsi, évaluer ESL sur une base par cellule dans le foie ou d’autres organes peut-être entraîner avances dans comment ESL programmer l’immunité tissulaire spécifique. Alors qu’une grande partie de la littérature qui se concentre sur l’ESL dans le foie utilise la microscopie pour visualiser les ESL à l’aide d’un ou deux marqueurs et morphologie17, très peu a été fait afin d’évaluer plus précisément ESL sur une base de la cellule par cellule à l’aide de cytométrie en flux, si une étude a fait évaluer les différences entre cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) et ESL18. Être capable d’analyser les populations ESL dans le foie par cytométrie en flux permet l’étude approfondie du phénotype LEC pendant homéostasie normale ou d’une maladie.

Evaluer ESL par cytométrie en flux, plusieurs marqueurs de surface sont nécessaires. En général, ESL sont visualisées par l’expression de prospero liés boîte homéotique 1 (Prox-1), le récepteur acide hyaluronique endothéliale de vaisseau lymphatique 1 (LYVE1) ou le récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 3 (VEGFR3) à l’aide de la microscopie. Toutefois, dans le foie, l’expression de ces marqueurs n’est pas limitée aux ESL. Prox-1 est largement exprimée par les hépatocytes pendant le développement du foie, régénération et blessures19, et LYVE1 et VEGFR3 sont exprimés par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques18. Dans le ganglion lymphatique, ESL sont identifiés comme des grappes de différenciation (CD) à l’aide de cytométrie CD45, CD31 + et podoplanin + (PDPN)16. Cependant, cette approche est trop minime pour isoler les ESL dans le foie comme cellules CD45 - CD31 + capturera les cellules endothéliales, et la population prédominante des cellules endothéliales vasculaires dans le foie est LSECs. Ainsi, les autres marqueurs sont nécessaires pour distinguer la population ESL rare de la population de LSEC abondante. CD16/32 (exprimées par mature LSECs18) et CD146 (un cellule endothéliale vasculaire marqueur commun qui est principalement exprimé dans les sinusoïdes du foie par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques20 avec peu ou aucune expression de lymphatique les cellules endothéliales21) ont été les marqueurs candidats.

Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour isoler et visualisation des ESL dans le foie aide ci-dessus marqueurs, CD45, CD31, CD146, CD16/32 et PDPN pour la cytométrie en flux. Nous décrivons l’utilisation de collagénase IV, DNase 1 et séparation mécanique pour la digestion du tissu hépatique en une suspension de cellules individuelles. Nous décrivons également l’utilisation de gradient de densité d’iodixanol pour l’isolement de cellules non parenchymateuses (NPC) et d’éliminer les débris cellulaires. Enfin, à l’aide de plusieurs marqueurs, nous déterminons la stratégie de blocage de cytométrie en flux flux optimal pour identifier des ESL du foie avec PDPN comme marqueur prédominant.

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Protocole

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Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Colorado Campus médical d’Anschutz.

1. préparation des matériaux

  1. Préparer une solution de 5 mg/mL de DNase I dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Faire un mélange de digestion en ajoutant 5 000 U/mL de collagénase IV aux médias EHAA de clic.
  3. Réchauffer le mélange de digestion à 37 ° C pendant 30 min avant de l’utiliser.
  4. Faire un tampon d’isolement en ajoutant 4,8 % d’albumine sérique bovine (BSA) et l’acide éthylènediaminetétraacétique 2 mM (EDTA) à Hanks balanced solution saline (HBSS).
  5. Faire un tampon de lyse des globules rouges (RBC) en ajoutant le chlorure d’ammonium 100 mM, 10 mM KHCO3et 0,1 mM EDTA à eau distillée H2O.

2. Elaboration d’une Suspension de cellules individuelles d’un foie de souris

  1. Euthanasier la souris avec le CO2 et de la dislocation cervicale.
  2. Vaporiser vers le bas de la souris avec l’éthanol à 70 % pour mouiller sa fourrure. Broche de la souris pieds devant un Conseil de dissection.
  3. Utiliser des ciseaux de dissection pour couper la peau environ 1 cm au-dessus de l’anus, en veillant à ne couper qu’à travers la peau (environ 1 mm). Tirez la peau du corps avec une pince crantée et insérer les ciseaux entre la peau et le péritoine. Ouvrez les ciseaux pour séparer la peau du péritoine et, ensuite, couper la peau de l’incision au cou.
  4. Épinglez la peau à l’Office de la dissection à l’aide d’une broche sous chaque bras et au-dessus de chaque jambe. Tirer le sac péritonéal et couper vers le haut vers le cou. Saisir les lobes du foie et coupez juste en dessous du sternum.
    Remarque : Il faut si tout du foie sera utilisé pour l’immunohistochimie (IHC).
  5. Couper autour du foie et retirez le foie de la souris et le placer dans 4 mL de médias EHAA de clic.
  6. À l’aide d’un scalpel, couper le foie en ~ 1 mm de diamètre.
  7. Ajouter 500 µL du mélange digestion et 500 µL de la DNase I (2 mg/mL) pour le foie.
  8. Incuber le foie pendant 30 min à 37 ° C. Après 15 min, mélanger le liquide à l’aide d’une pipette de 5 mL.
  9. Après 30 min d’incubation, transférer l’échantillon digéré à travers un tamis de 100 µm dans un tube conique de 50 mL.
  10. Poussez délicatement les pièces restantes à travers le filtre avec le piston d’une seringue de 1 mL.
  11. Laver le filtre avec 5 mL de tampon d’isolement et poussez doucement le tissu à travers la passoire avec le dos d’un piston d’une seringue de 1 mL. Répétez cette procédure jusqu'à ce que le filtre est lavé avec 25 mL de tampon d’isolement.
  12. Centrifuger les cellules à 400 g pour 5 min. aspirer soigneusement éteint le surnageant.
  13. Resuspendre le culot avec 4 mL de tampon de lyse de RBC. Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 min.
  14. Laver les cellules avec 10 mL de tampon d’isolement et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
  15. Compter les cellules sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre complet de foie.
  16. Remettre en suspension des cellules dans 5 mL d’iodixanol de 20 % et leur couche avec 1 mL de PBS.
  17. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 15 min sans un frein.
  18. Enlever la couche entre le CPE et l’iodixanol et placez-les, à travers un filtre de 100 µm, dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  19. Laver les cellules avec 10 mL de tampon d’isolement et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
  20. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules de 500 µL de PBS avec 2 % sérum fœtal (SVF).

3. cytométrie de cellules du foie

  1. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et microscope, utilisant le bleu trypan exclusion pour mesurer les cellules viables. Ajouter 10 µL de cellules à 10 µL de bleu trypan et placez-les immédiatement sur un hémocytomètre et compter les cellules vivantes (pas bleus) sous un microscope. Ensuite, calculez le nombre de cellules par microlitre.
  2. Aliquote environ 5 millions de cellules parenchymateuses restantes dans un seul puits d’une plaque de 96 puits.
  3. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules 90 µL de PBS contenant 2 % FBS.
  5. Ajouter anti-CD45 (1 : 200), anti-CD146 (1 : 200), anti-CD31 (1 : 200) et PDPN (1 : 200) diluée dans 10 µL de 10 x 2.4G2 ou anti-CD16/32 (1 : 200).
    Remarque : Aucun bloc de Fc (2.4G2) a été utilisé lorsqu’on utilise des anticorps anti-CD16/32-étiqueté.
  6. Pour déterminer où les portes positives et négatives doivent être définies, inclure une fluorescence moins une tache (FMO) pour chaque couleur et un anticorps de contrôle isotype.
  7. Pour déterminer les vivants contre les cellules mortes, détachant avec un marqueur de viabilité (p. ex., le fantôme rouge 780). Incuber les cellules à 4 ° C pendant 30 min.
  8. Laver les cellules avec 100 µL de PBS contenant 2 % FBS.
  9. Une petite aliquote de cellules permet d’ajuster les paramètres laser et de compensation sur le cytomètre en flux. Colorer les cellules avec un anticorps dirigé contre chaque fluorophore individuel et l’autre sans n’importe quel anticorps.
    Remarque : Selon le cytomètre en flux utilisé, une matrice de compensation devrait être établie pour éliminer le chevauchement spectrale.
  10. Placer le tube d’échantillon sur la sonde cytomètre et recueillir et enregistrer tous les événements.

4. analyse des données

  1. Regarder diffusion latérale aire vs attaquant-scatter, porte sur des cellules « vivantes » basé sur la taille et de granularité et de viabilité colorant marqueur.
  2. Ensuite, à l’aide de CD45 brillant Violet 510 et CD31 PerCp Cy5.5, porte sur les cellules CD45 - CD31 + à l’aide de l’isotype contrôles et FMO afin de déterminer les populations positives et négatives.
  3. Enfin, en utilisant CD146 v450 ou CD16/32 FITC et PDPN APC, prendre la CD146 - PDPN + ou CD16/32-PDPN + cellules, à l’aide de contrôles isotype et FMO, pour déterminer les populations positives et négatives. Ces cellules sont les ESL.

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Résultats

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Des études analysant les vaisseaux lymphatiques du foie ont principalement utilisé immunohistochemistry pour quantifier la fréquence et le diamètre des vaisseaux lymphatiques dans le foie. Cependant, cette méthode ne permet pas pour l’évaluation d’ESL sur une base de la cellule par cellule, ou pour l’expression de multiples marqueurs, cytokines, chimiokines ou des facteurs de transcription. Par conséquent, nous avons demandé si foie ESL pouvait être isolées du foie et évaluées à l’aide de...

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Discussion

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L’importance des ESL dans l’homéostasie du système immunitaire et la régulation est récemment venu à lumière25. Une grande partie de la littérature publiée lymphatique se concentre sur la peau et les ganglions lymphatiques ; Cependant, vaisseaux lymphatiques sont trouvent partout dans le corps26 et, par conséquent, notre compréhension de leur importance dans les différents organes est nécessaire. Nous montrons ici une méthode dans laquelle les ESL dans le foie peut être étu...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs aimeraient remercier les GI et les programmes système immunitaire innée de foie pour un soutien financier de ce projet. B.A.J.T. est également financé par R01 AI121209.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Clics/EHAA mediaIrvine Scientific9195
Collagénase IVWorthington Biochemical corporationLS004188
DNase IWorthington Biochemical corporationLS002145Désoxyribonucléase 1
OptiPrepSigma AldrichD1556Gradient de densité moyen
V450 anti souris CD146(clone ME-9F1)BD biosciences562232
FITC anti souris CD146 (clone ME-9F1)Biolegend134706Isothiocyanate de fluorescéine (FITC)
Pacific Blue anti souris CD31(clone 390)Biolegend102422
PerCp/Cy5.5 anti souris CD31(clone 390)Biolegend102420Protéines péridinine-chlorophylle-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti souris PDPN (clone 8.1.1)Biolegend127410Allophycocyanine (APC), podoplanine (PDPN)
APC/Cy7 anti souris CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
Brilliant Violet 510 anti souris CD45 (clone 30-F11)Biolegend103138
FITC anti souris CD16/32 (clone 93)Biolegend101306Isothiocyanate de fluorescéine (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti souris CD16/32(clone 93)Biolegend101324Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viabilité colorantTONBO biosceinces3-0865-T100
APC Syrian hamster IgG (clone SHG-1)Biolegened402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)Biolegend400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)ebioscience1-4321-80
Anti souris LYVE1 (clone 223322)R& D systemsFAB2125A
anti-souris Cytokératine (clone EPR17078)abcamab181598
anti-souris F4/80 (clone Cl :A3-1)Bio-radMCA497
BSA (fraction V)FischerBP1600-100Albumine sérique bovine (BSA)
Sérum de chèvreJackson Immunoresearch017-000-121
Sérum d’âneJackson Immunorecherche017-000-121
EDTAVWRE177Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) -pour tampon de lyse des globules rouges
Chlorure d’ammoniumFischerA687-500pour tampon de lyse des globules rouges
Bicarbonate de potassiumFischerP184-500pour tampon de lyse des globules rouges
ScalpelFeather2975#21
100 &mu ; Passoire à cellules mFischer22363549
2.4G2in house/ATCCATCC HB-197Bloc FC pour inhiber la liaison non spécifique aux cellules Fc gamma + -fabriqué à partir d’hybridome
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Corning21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14185-052
Sérum fœtal bovin (FBS)Atlanta biologicalsS11550
Plaque 96 puitsCorning3788
Plaque 6 puitsCorning3506
50 mL coniqueTrulineTR2004
15 mL coniqueFalcon352196
1 mL Pointe de pipetteUSA scientific1111-2721
200 µ ; Pointe de pipette LUSA scientific1110-1700
10 & micro ; Pointe de pipetteL USA scientific1111-3700
pipette sériologique 10 mLgreiner bio-one607107
sériologique 5 mL pipetegreiner bio-one606107
Incubateur de cellulesFischerHeracell 160i
BD FacsCanto II cytomètre en fluxBD biosciences
Centrifugeuse cliniqueBeckman soc modèle X-14R

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740(2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771(2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034(2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989(2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131(2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).

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Mots-clés

Cellules endoth liales lymphatiques h patiquesprotocole de digestion du foieisolation de la fraction vasculaire stromales paration par gradient de densitlyse des globules rougesmarquage la podoplanineCD45 n gatif CD31 positiftubes de cytom trie en fluxcolorant marqueur de viabilit

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