림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화
Summary
이 프로토콜의 목표 설명된 마커를 사용 하 여 간 내 림프 내 피 세포 인구를 식별 하는 것입니다. 우리는 콜라 IV 및 DNase 및 조직, 림프 내 피 세포의 명료한 인구를 식별 하기 위해 cytometry와 결합의 부드러운 닦지를 이용 한다.
Abstract
간, 내 림프 혈관 포털 깡패 내에서 발견 되 고 그들의 설명한 기능 세포 파편과 항을 조사 수 있는 림프절을 간에서 틈새 액체를 제거 하는. 우리는 림프 맥 관 구조 염증 및 간 내에서 면역 세포 기능에 관여 하는 수도 있습니다 어떻게 이해에 매우 관심이 다입니다. 그러나, 아주 작은 게시 된 간 또는 간 평가 하는 데 사용할 수 있는 특정 마커 (LECs)의 림프 내 피 세포의 고립에 대 한 소화 프로토콜 설정 LECs 당 셀 기준. 따라서, 우리는 소화와 간에서 LEC 인구를 평가 하기 위해 간 얼룩에 대 한 방법을 최적화 합니다. 우리는 여기에 설명 된 방법을 식별 및 간에서 LECs의 격리에 대 한 도움이 될 것입니다 LECs 간 microenvironment에 대응 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 강화할 것 이다 확신.
Introduction
간에서 림프 혈관 및 LECs의 역할은 잘 이해 되지. 림프 혈관 간1 의 포털 3 인조 내의 질병2중 확장 하는 동안 아주 작은 기능 및 간 내 LECs의 표현 형에 관한 이해 된다. LECs3에 주로 발견 되는 마커의 발견과 항상성 및 질병에 다른 조직 틈새 내의 이러한 셀의 중요성 우리의 이해에 중요 한 격차를 채울 것입니다. LECs는 T 세포4,,56,7,8, 와 직접 상호 작용 하 여 림프 노드 및 전이성 종양 주변 공차를 유지 하는 주요 역할 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 림프 노드에서 LECs 철새 수지상 세포14,,1516와 그들의 상호 작용을 통해 보호 면역을 홍보할 수 있습니다. 따라서, 특정 조직에 있는 그들은 존재 하는 상호 작용 수 있는 LECs에 대 한 여러 역할이 있습니다. 그러나, 아주 작은 LECs 조직에서 면역 세포 상호 작용 하는 방법 또는 다른 기관 체계; LECs 작동 하는 방법에 대 한 이해는 따라서, 간 또는 다른 장기에서 세포 당 기준 LECs 평가 어떻게 LECs 조직 특정 면역 프로그램에서 발생할 수 있습니다. 문학에 초점을 맞춘 LECs 간에서 많이 LECs 하나 또는 두 개의 마커 및 형태학17를 사용 하 여 시각화를 현미경을 사용 하 여, 하는 동안 아주 작은 일 하고있다 특히 cytometry, 비록 한 연구를 사용 하 여 셀에 의해 셀 별로 LECs를 평가 하 한 간 사인 내 피 세포 (LSECs), LECs18간의 차이 평가. Cytometry 여 간에서 LEC 인구를 분석할 수 있는 정상적인 항상성 또는 질병 동안 LEC 표현 형의 심도 있는 연구에 대 한 수 있습니다.
LECs cytometry로를 평가 하려면 여러 표면 마커 필요 합니다. 일반적으로, LECs 지주 님 관련 homeobox 1의 표현 (Prox-1), 림프 혈관 내 피 hyaluronan 수용 체 1 (LYVE1) 또는 혈관 내 피 성장 인자 수용 체 3 (VEGFR3) 현미경을 사용 하 여 시각화 됩니다. 그러나,이 간,이 마커의 식 LECs 제한 되지 않습니다. Prox 1 널리 간 개발, 재생, 및 부상19, hepatocytes에 의해 표현 하 고 LYVE1 및 VEGFR318간 사인 내 피 세포 의해 표현 됩니다. 림프절, LECs cytometry 차별화 (CD)의 클러스터로 사용 하 여 식별 됩니다 CD45-CD31 +, podoplanin + (PDPN)16. 그러나,이 방법은 너무 CD45-CD31 + 세포는 내 피 세포와 간에서 혈관 내 피 세포의 주된 인구는 LSECs 이후 간에서 LECs을 최소 이다. 따라서, 다른 마커는 풍부한 LSEC 인구에서 드문 LEC 인구 구분 필요 합니다. CD16/32 (성숙 LSECs18에 의해 표현)와 CD146 (일반적인 혈관 내 피 세포 마커를 주로 림프 여 식이 없는 거의 간 사인 내 피 세포20 여 간 사인 내 표현 내 피 세포21) 후보 마커를 했다.
따라서, 우리는 분리 하 고 간 cytometry에 대 한 위의 마커, CD45, CD31, CD146, CD16/32, 및 PDPN를 사용 하 여에서 LECs을 시각화 하는 방법을 최적화 합니다. 우리는 콜라 4의 사용, DNase 1, 및 단일 셀 서 스 펜 션에 간 조직 소화에 대 한 기계적 분리 설명합니다. 우리는 또한 세포질 파편을 제거 하 고 비 parenchymal 세포 (NPC)의 분리에 대 한 iodixanol 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 설명 합니다. 주된 마커로 PDPN 간에서 LECs을 식별 하는 최적의 흐름 cytometry 제어 전략을 결정 마지막으로, 여러 개의 마커를 사용 하 여, 우리.
Protocol
Representative Results
Discussion
빛25LECs의 전반적인 중요성 면역 항상성 그리고 규칙에 최근에 왔다. 게시 된 림프 문학의 많은 피부와 림프절;에 초점을 맞추고합니다 그러나, lymphatics26 신체 걸쳐 발견 되 고, 따라서, 다른 기관에 그들의 중요성의 우리의 이해는 필요 하다. 여기 우리가 다른 표면 마커, cytokines, 발산, 및 녹음 방송 요인 등 세포내 단백질의 그들의 동시 표현 이해 하기 셀에 의?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 기 및 간 타고 난 면역 프로그램이이 프로젝트의 통화 지원에 감사 하 고 싶습니다. B.A.J.T.는 또한 R01 AI121209에 의해 자금을.
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
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