Fordøyelsen av Murine leveren for en flyt Cytometric analyse av lymfatisk endotelceller
Summary
Målet med denne protokollen er å identifisere lymfatisk endothelial celle populasjoner i leveren bruker beskrevet markører. Vi benytter collagenase IV og DNase og en mild hakking av vev, kombinert med flowcytometri, for å identifisere forskjellige innbyggere lymfatisk endotelceller.
Abstract
Lymfekar finnes innenfor portalen triad leveren, og deres beskrevet funksjon er å fjerne interstitiell væske fra lever til lymfeknutene der mobilnettet rusk og antigener kan undersøkes. Vi er svært interessert i å forstå hvordan den lymfatiske blodkar kan være involvert i betennelser og immun celle funksjon i leveren. Men lite har blitt publisert etablering fordøyelsen protokoller for isolering av lymfatisk endotelceller (LECs) fra leveren eller spesifikke indikatorer som kan brukes til å evaluere lever LECs på per celle basis. Derfor optimalisert vi en metode for fordøyelsen og flekker av leveren for å vurdere LEC befolkningen i leveren. Vi er sikker på at metoden skissert her vil være nyttig for identifisering og isolering av LECs fra leveren og vil styrke vår forståelse av hvordan LECs reagerer på leveren microenvironment.
Introduction
Rollen lymfekar og LECs i leveren er ikke godt forstått. Mens lymfekar finnes innenfor portalen triaden av leveren1 og utvide under sykdom2, er lite forstått om funksjonen og fenotypen av LECs i leveren. Med oppdagelsen av indikatorer som finnes på LECs3, fyller betydningen av disse cellene i ulike vev nisjer i homeostase og sykdom en betydelig gap i vår forståelse. LECs spiller en viktig rolle i å opprettholde perifere toleranse lymfeknute og metastatisk svulster av samhandler direkte med T celler4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs i lymfeknute kan fremme beskyttende immunitet via deres samhandling med vandrende dendrittiske celler14,15,16. Derfor finnes det flere roller for LECs som kan være spesifikk for vev og interaksjoner som de er til stede. Imidlertid forstått lite om hvordan LECs sammen med immunceller i vev eller hvordan LECs fungerer i ulike organsystemer; Dermed kan evaluere LECs på per celle basis i leveren eller andre organer føre til fremskritt i hvordan LECs programmet vev-spesifikke immunitet. Mens mye av litteraturen som fokuserer på LECs i leveren bruker mikroskopi for å visualisere LECs bruke ett eller to markører og morfologi17, er svært lite gjort for å evaluere LECs på celle for celle basis med flowcytometri, men en studie vurdere forskjellene mellom leveren sinusformet endotelceller (LSECs) og LECs18. Å kunne analysere LEC populasjoner i leveren av flowcytometri tillater fordypning i LEC fenotypen under normale homeostase eller sykdom.
For å evaluere LECs av flowcytometri, er flere overflate markører nødvendig. LECs er vanligvis visualisert uttrykk for prospero-relaterte homeobox 1 (Prox-1), lymfatisk fartøy endothelial hyaluronan reseptor 1 (LYVE1) eller vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 3 (VEGFR3) bruker mikroskopi. Men i leveren er uttrykk for disse markørene ikke begrenset til LECs. Prox-1 er mye uttrykt av hepatocytter under leveren utvikling og regeneration skade19, og LYVE1 og VEGFR3 er uttrykt av leveren sinusformet endotelceller18. I lymfeknute, LECs identifiseres med flowcytometri som klynger av differensiering (CD) CD45, CD31 + og podoplanin + (PDPN)16. Men er denne tilnærmingen for minimal isolere LECs i leveren siden CD45 – CD31 + celler vil fange endotelceller, og den dominerende befolkningen vaskulær endotelial celler i leveren er LSECs. Dermed for andre markører å skille sjeldne LEC befolkningen fra rikelig LSEC befolkningen. Både CD16/32 (uttrykt av eldre LSECs18) og CD146 (en vanlig vaskulær endotelial celle markør som er hovedsakelig uttrykt i leveren sinusoids av leveren sinusformet endotelceller20 med liten eller ingen uttrykk av lymfatiske endotelceller21) var kandidat markører.
Derfor optimalisert vi en metode for å isolere og visualisere LECs i leveren bruker ovenfor markører, CD45, CD31, CD146, CD16/32, og PDPN for flowcytometri. Vi beskriver bruk av collagenase IV, DNase 1 og mekanisk separasjon for leveren vev fordøyelsen en enkeltcelle suspensjon. Vi beskriver også bruk av iodixanol tetthet gradert for isolering av ikke-parenchymal celler (NPC) og å eliminere mobilnettet rusk. Til slutt fastslå bruker flere indikatorer, vi den optimale flyt cytometri gating strategien for å identifisere LECs fra lever med PDPN som den dominerende markøren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generelle betydningen av LECs i immun homeostase og regulering har nylig kommet til lys25. Mye av publiserte lymfatisk litteraturen fokuserer på huden og lymfeknuter; imidlertid lymfekar finnes i hele kroppen26 , og dermed vår forståelse av deres betydning i ulike organer er nødvendig. Her viser vi en metode der LECs i leveren kan studeres celle for celle for å forstå deres samtidige gjengivelsen av forskjellige overflate markører, cytokiner, chemokines og intracellu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke GI og leveren medfødte immunsystemet programmer for økonomisk støtte til dette prosjektet. B.A.J.T. er også finansiert av R01 AI121209.
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver–re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from “oval cells”. Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).
