Byggingen av et flerlags Mesenchymal stamceller ark med en 3D dynamisk kultur-systemet
Summary
Denne artikkelen gir en effektiv og mulig måte for å konstruere flerlags stamcelleforskningen ark med gunstige stamcelleforskningen eiendom.
Abstract
Stilk cellen terapi viser en lovende fremtid regenererer skadet orgel og vev, og cellen ark teknikken har blitt utviklet for å forbedre lav celle oppbevaring og dårlig overlevelse innenfor målsonen. Men under byggeprosessen i vitro en løsning for å opprettholde stilk cellen bioactivity og øke celle i cellen arket er et presserende behov. Her gir denne protokollen en metode for å konstruere et flerlags celle ark med gunstige stilk cellen bioactivity og optimal brukbarhet. Decellularized svin pericardium (DPP) er utarbeidet av fosfolipase2 (PLA2) decellularization metode som cellen ark stillaset, og rotta benmarg mesenchymal stamceller (BMSCs) er isolert og utvidet som seeded cellene. Midlertidig flerlags ark cellestrukturen er konstruert ved hjelp av RAD16-jeg peptid hydrogel. Endelig celle arket er kultivert med en dynamisk perfusjon å stabilisere tredimensjonale (3D) strukturen, og cellen arket kan hentes etter en 48-timers kultur i vitro. Denne protokollen gir en effektiv og mulig metode for å konstruere et flerlags stamcelleforskningen ark, og cellen arket kunne utvikles som gunstige stilk cellen terapi produkt i fremtiden.
Introduction
Stilk cellen terapi har blitt rapportert som en effektiv behandling for mange sykdommer; lav celle oppbevaring og dårlig overlevelse innenfor målsonen beholdes imidlertid kritiske problemer etter tradisjonelle stamcelleforskningen injeksjon. For å løse dette problemet, utviklet vev engineering forskere celle ark teknikken. Et monolayered celle ark med intakt ekstracellulær matrix ble først utarbeidet ved hjelp av temperatur-svar kultur parabol1, og dens oppfølgingsstudier rapportert betydelige forbedringer av stilk cellen bevaring og overlevelse i den infarcted området2,3. Blant metodene, har konstruere flerlags celle arket blitt rapportert som en effektiv strategi for å forbedre celle overlevelse og celle ark terapeutisk effekt3,4. Siden da har forskere jobbet med å utvikle ulike celle ark konstruksjonsmetoder for å øke celle beløpet, Stamcelle eiendom og mekanisk-egenskapen for cellen arkene. Så langt, visse typer celle ark er konstruert og studerte i behandlingen av hjerteinfarkt5, brusk skade6, og huden sår7.
Bioactivity av stamceller før transplantasjon viste en voksende innflytelse på skadet vev gjenfødelse, og ulike celle ark bygging strategier har ulike effekter på stamceller. På den ene siden confluent celle ark bare besto av høy tetthet stamceller og naturlig ekstracellulære matriser kan skaffes ved stabling monolayered celle ark8 eller magnetiske tissue engineering teknikker9. På den annen side, utviklet forskere ulike stillaser for å gi tilstrekkelig mekanisk styrke og støtte celle vekst10,11,12, som tillot en lav stamcelleforskningen seeding tetthet for å sikre ernæring Angi. Til tross for disse tilnærmingene imidlertid lav effektiv ernæring levering innen flerlags ark cellestrukturen et stort problem under bygging i vitro . Derfor er en effektiv og mulig celle ark bygging systemet raskt påkrevd.
Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å forberede en multilayeredmesenchymal stilk cellen (MSC) cellen ark. I dette bygging systemet, er celle ark mekanisk styrke levert av en DPP. Basert på denne skafottet, 3D cellestrukturen raskt konstrueres med RAD16-jeg peptid hydrogel, og en dynamisk perfusjon system brukes til kultur flerlags celle arket, for å stabilisere ark for 3D cellestruktur og gi tilstrekkelig ernæring tilførsel til cellene. Bruke dette systemet, et flerlags BMSC ark var er forberedt og utstilt en optimal terapeutisk effekt på rotte hjerteinfarkt modell13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nåværende protokollen rapporterer en effektiv metode for å lage en flerlags MSC ark. Denne cellen ark utstillinger optimal mekanisk styrke, høyt seeding tetthet og gunstige stamcelleforskningen bioactivity. Bruker BMSCs som et eksempel, 3D cellestrukturen er raskt konstruert med RAD16-jeg peptid hydrogel. Etter blir kultivert i dynamiske perfusjon systemet, flerlags BMSC arket er med hell fått og BMSCs opprettholde en høy uttrykk for stamcelleforskningen markører.
Opprette midlertidige …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (bevilgning nummer 31771064); Vitenskap og teknologi planlegging prosjektet av Guangdongprovinsen (grant tall 2013B010404030, 2014A010105029 og 2016A020214012); Vitenskap og teknologi planlegging prosjektet Guangzhou (bevilgning nummer 201607010063); og undervisning innovasjon og entreprenørskap treningsprogram (bevilgning nummer 201610559028); National Science Foundation for unge forskere i Kina (gi nummer 31800819).
Materials
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
References
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
- Narita, T., et al. The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects. International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).
- Narita, T., et al. The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure. Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).
- Matsuo, T., et al. Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction. Circulation. 128 (22), (2013).
- Alshammary, S., et al. Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction. Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).
- Chen, G. P., et al. The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).
- Cerqueira, M. T., et al. Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).
- Ishii, M., et al. Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).
- Godier-Furnemont, A. F., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Liu, Y., et al. Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction. American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).
- Arana, M., et al. Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction. Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).
- Wang, Y., et al. Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system. Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).
- Wu, Z., et al. The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold. Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).
- Degano, I. R., et al. The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation. Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).
- Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials. Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).
- Cui, X. J., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).
- Jun, I., et al. Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).
- Chen, C. H., et al. Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair. Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).
